DNA Polymerase I 在模板和引物 (DNA或RNA) 存在的条件下,以dNTP作底物,沿5′→3′方向合成与模板互补的DNA。本酶分子量约为109,000,具有双链特异性的5′→3′外切核酸酶活性以及单链特异性的3′→5′外切核酸酶的活性。本酶是由带有编码E.coli DNA Polymerase I基因的大肠杆菌精制而成的。
■ 保存
-20℃。
■ 起源
Escherichia coli carrying the plasmid which encodes the gene of Pol I.
■ 活性定义
以合成的Poly d (A-T) DNA为模板/引物,在37℃、pH7.4的条件下,30分钟内使10 nmol 的全核苷酸掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位 (unit)。
■ 用途
1. 与DNase I (Code No. 2270A/B) 一起使用,进行切口平移 (Nick translation)。 2. 通过Okayama-Berg法合成cDNA的第二条链 (0.3 μg DNA Polymerase I 约为2.5 units)。
本酶催化在各种多聚核糖核酸的3′末端聚合A碱基的反应。反应中使酶达到高活性所需的盐浓度为300-400 mM NaCl。能以多种单链RNA作引物,双链RNA以及合成的多聚核苷酸、短的寡聚核苷酸等不宜作引物;DNA也不能作引物。本酶因聚合AMP碱基,故只能用ATP作底物,ADP、dATP均不能作为底物。另外,UTP、CTP的掺入不足ATP的5%,而GTP也不能作为底物进行聚合。
■ 保存
-20℃。
■ ATP的掺入个数和时间的关系
以1 mM ATP作底物,15 U的Poly(A) Polymerase作用于84 μg RNA所得到的结果如下:
MightyAmp DNA Polymerase是追求高反应性能开发的PCR酶,由于本酶具有很强的扩增性能,对于使用普通PCR酶难以扩增的样品,也显示出很好的扩增能力,如含有大量PCR阻害物的生体粗提样品。 MightyAmp DNA Polymerase Ver.3是对MightyAmp DNA Polymerase进行了改良,与Ver.2相比,这种改良后的PCR酶和Buffer组合使用,可进一步增强对PCR阻害物的抵抗性。此外,也提高了血液、动植物组织等生物体样品直接加入到反应液中的Direct PCR的反应性能。 无论是PCR阻害物含量较多的粗提样品,还是GC Rich、AT Rich的模板均可在宽广的模板范围内进行有效扩增,并根据需要将试剂盒中附带的10×Additive for High Specificity添加到PCR反应液中可提高PCR扩增的特异性和检测灵敏度。 本酶是使用单克隆抗体的Hot Start型PCR扩增用DNA聚合酶,98℃高温加热前,抗体与酶结合,有效抑制聚合酶活性。
■ 保存
-20℃。
■ 注意事项:
1. 先使用不含10×Additive for High Specificity的反应体系进行PCR扩增。想进一步提高扩增特异性和检测灵敏度时再添加10×Additive for High Specificity进行PCR扩增。 2. 动物组织进行Direct PCR的扩增产物电泳时,建议在Loading Buffer中添加Proteinase K。