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Embgenix PGT-A Kit (RUO) | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 634760 | Embgenix PGT-A Kit (RUO) | 96 Rxns | ¥69,733 |
胚胎植入前染色体非整倍体分析(科研用) Embgenix PGT-A Kit (RUO) |
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Embgenix PGT-A Kit (RUO) | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 634760 | Embgenix PGT-A Kit (RUO) | 96 Rxns | ¥69,733 |
胚胎植入前染色体非整倍体分析(科研用) Embgenix PGT-A Kit (RUO) |
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Embgenix™ ESM Screen Kit | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 634782 | Embgenix™ ESM Screen Kit | 96 Rxns | ¥74,192 |
Embgenix™ ESM Screen Kit | |||||||
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SMART-Seq mRNA Single Cell LP & SMART-Seq mRNA Single Cell | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 634786 | SMART-Seq mRNA Single Cell LP | 24 Rxns | ¥17,917 | ||
Clontech | 634787 | SMART-Seq mRNA Single Cell LP | 96 Rxns | ¥60,919 | ||
Clontech | 634788 | SMART-Seq mRNA Single Cell LP | 4×96 Rxns | ¥219,310 | ||
Clontech | 634789 | SMART-Seq mRNA Single Cell | 24 Rxns | ¥15,184 | ||
Clontech | 634790 | SMART-Seq mRNA Single Cell | 96 Rxns | ¥51,626 | ||
Clontech | 634785 | SMART-Seq mRNA Single Cell | 4×96 Rxns | ¥185,856 |
SMART-Seq mRNA Single Cell LP & SMART-Seq mRNA Single Cell | |||||||
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图1. SMART-Seq mRNA Single Cell & SMART-Seq mRNA Single Cell LP的cDNA合成流程 | |||||||
图2. SMART-Seq mRNA Single Cell LP的文库制备工作流程 | |||||||
■ 数据展示: | |||||||
注:以下展示来源于SMART-Seq Single Cell Kit (SSsc) 和 SMART-Seq Single Cell PLUS (SSsc PLUS)的数据。因为两者分别是SMART-Seq mRNA Single Cell 和SMART-Seq mRNA Single Cell LP等效替换品。 | |||||||
● 灵敏度更高的单细胞全长转录组分析 | |||||||
图3. 与Smart-seq2法的比较 | |||||||
Takara科学家以淋巴母细胞系GM12878单细胞为样本制备文库,分别采用SMART-Seq Single Cell Kit(SSsc,18个重复)和Smart-seq2法(Smart-seq2,20个重复)合成cDNA(均进行19个PCR循环扩增),所有样本都均一化至1.75M paired-end reads,然后制备RNA-Seq文库并进行测序分析。 Panel A 根据cDNA的制备方法不同,结果也不同。相比而言,Smart-seq2结果中比对到线粒体基因组的比率较高,而检测到基因鉴别的reads数相对较少。 Panel B SMART-Seq Single Cell Kit能检测到比Smart-seq2更多的基因。 |
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● SMART-Seq mRNA Single Cell LP提供完整的单细胞RNA-Seq建库体验! | |||||||
图4. 与其他同类产品比较数据 | |||||||
Panel A. 以10 pg小鼠脑total RNA起始,采用SMART-Seq Single Cell Kit完成cDNA合成。随后分别采用SSsc Plus Kit中的SMART-Seq Library Prep Kit模块与市面上较常用的A公司试剂盒构建文库,并比较性能差异。 Panel B. 从测试数据中可以看出,SSsc PLUS Kit所建文库的产量是A公司Kit产量的5倍,而更高的文库产量更适于高通量型Illumina测序仪,如Novaseq。 Panel C. 两种方法所建文库随后用Nextseq 500完成测序,并对TPM(Transcripts per million)≥0.1的基因数进行统计。相较于A公司文库,SSsc PLUS文库能检出更多的基因,从同样的cDNA起始能“捕获”更全的信息! |
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microRNA定量(qRT-PCR) | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 638315 | Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit | 60 Rxns | ¥4,953 | ||
Clontech | 638313 | Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit | 20 Rxns | ¥3,213 | ||
Clontech | 638314 | Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green® Kit | 20 Rxns RT;200 Rxns qPCR | ¥5,007 | ||
Clontech | 638316 | Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green® Kit | 60 Rxns RT;600 Rxns qPCR | ¥10,485 |
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重组Cas9蛋白质(10 μg/μl) | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 632678 | Guide-it™ Recombinant Cas9 (10 μg/μl) | 200 μg | ¥4,890 | ||
Clontech | 632679 | Guide-it™ Recombinant Cas9 (10 μg/μl) | 500 μg | ¥9,106 |
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Guide-it Recombinant Cas9是一种重组野生型酿脓链球菌Cas9核酸酶,在C-端进行了核定位信号(NLS)修饰,可用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑实验。通过电穿孔的方式将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入至哺乳动物细胞,在使脱靶效应最小化的同时,更容易实现高效率的基因编辑实验。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Guide-it Recombinant Cas9 (10 μg/μl)甘油含量为50%,这款Cas9蛋白质溶液已被证实是无菌的,并且无论是和单向导RNA(sgRNA)形成核糖核蛋白复合物(RNP)通过电穿孔的方式导入用于基因敲除实验,还是作为RNP与供体修复模板一起导入用于基因敲入实验,都具有良好的哺乳动物细胞耐受性。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
sgRNA制备推荐使用Guide-it sgRNA In VitroTranscription Kit(Code No. 632635)或者Guide-it Complete sgRNA Screening System(Code No. 632636)。 |
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GMP级别的重组Cas9蛋白质Recombinant Cas9 Protein GMP grade(Code No. T230)请点击这里查看。 |
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■ 概览 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
· 这款Cas9蛋白质溶液是无菌的,且哺乳动物细胞耐受性良好 · 与Guide-it Complete sgRNA Screening System配合使用可实现高效率编辑 · 优于质粒导入系统,脱靶效应更低 · 对难转染细胞系效果好 |
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■ 实验例: | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
人诱导多能干细胞(hiPSC)CD81基因敲除效果。在本实验中,将Cas9-sgRNA RNP复合物通过电穿孔方式导入至hiPSC-18 和hiPSC-22两种诱导多能干细胞中敲除CD81基因。CD81抗体染色后流式细胞术检测结果显示,电穿孔10天后hiPSC-18的敲除效率为91%,hiPSC-22的敲除效率为85%,显示出非常高的基因编辑效率。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAVS1和CXCR4基因同源定向修复。Panel A. 这些图表展示了CD34+造血干细胞的HDR实验是如何完成的。将含有Hind III酶切位点的ssDNA模板插入AAVS1基因中,将同时含有Hind III和Bam HI酶切位点的模板插入CXCR4基因中。每侧同源臂长度为90 bp。Panel B. 将修复模板和Cas9/sgRNA RNPs通过电穿孔导入后,用PCR扩增靶细胞中各目标基因,并进行酶切分析。编辑效率显示在凝胶上每个阳性孔上面。CXCR4基因经过BamH I酶切后显示出一条额外条带,原因是基因编辑前野生型基因中已经存在一个BamH I位点了。基因编辑5天后,我们证实98%的造血干细胞CD34+染色阳性。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
数据来源于Takara Bio USA, Inc. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cellartis hiPSC-18细胞系基因敲除。通过剪切后条带的强度可以对编辑细胞所占的百分比进行半定量估计。与其他品牌推荐的制备向导RNA的方法相比,Guide-it Recombinant Cas9与Guide-it In Vitro Transcription Kit制备的sgRNA结合使用,可以为许多靶点提供一致且有效的基因编辑。凝胶底部的每个数字代表所示RNP的基因编辑效率(以百分比表示)。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CD3+ Pan T细胞治疗相关基因的敲除。在本实验中,电穿孔导入Cas9/sgRNA RNPs至 CD3+Pan T细胞进行单基因敲除(B2M或PD-1)或双基因敲除(B2M+PD-1或TRAC+TRBC)。细胞解冻后,在LymphoONE培养基中生长,并用ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂激活处理3天。然后按照Guide-it Recombinant Cas9(10 μg/μl)操作指南,将RNP复合物通过电穿孔方式导入至细胞,设置3个平行实验组。对于双基因敲除,单独制备靶向各目标基因的RNP复合物,然后与细胞混合进行电穿孔。电穿孔7天后,使用流式细胞仪检测基因敲除频率。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CD3+ Pan T细胞中B2M基因的敲除。在本实验中,将Cas9/sgRNA RNPs通过电穿孔导入至CD3+ Pan T细胞中,以敲除B2M基因。细胞解冻后,在LymphoONE培养基中生长,并用ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂激活处理3天。然后按照Guide-it Recombinant Cas9(10 μg/μl)操作指南,将RNP复合物通过电穿孔导入至细胞,设置3个平行实验组。电穿孔7天后,用流式细胞仪检测基因敲除频率和细胞活力。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Technical Notes | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Improved CRISPR/Cas9 genome editing in hard-to-transfect mammalian cells using AAV | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Guide-it™ Recombinant
Cas9(10 μg/μl) |
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产品详情请点击: | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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基因编辑后突变检测 | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 631443 | Guide-it Mutation Detection Kit | 100 Rxns | ¥5,935 | ||
Clontech | 631448 | Guide-it Mutation Detection Kit | 25 Rxns | ¥2,684 |
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Guide-it™突变检测试剂盒可以用于确认由CRISPR/Cas9、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶所导入的基因突变。本试剂盒采用简单的PCR方法即可简便快速地检测出基因突变。性能卓越的 Terra™ PCR Direct Polymerase Mix可直接以细胞为起始进行扩增,无需提取基因组DNA。扩增产物经过变性及退火处理后形成不完全匹配DNA,Guide-it解离酶会剪切错配DNA部分,之后通过琼脂糖凝胶电泳确认剪切产物。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
■ 特点 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
· 识别哺乳动物细胞中插入或者缺失突变的简便方法 · 可直接以细胞为起始进行PCR扩增,与同类产品相比较更为快速有效 · 完整试剂盒: 包含Guide-it Resolvase、Terra PCR Direct Polymerase和所有缓冲液 · 规格: 可提供100次和25次反应规格,25次反应规格可用于小规模基因编辑实验 · 可用于CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs下游研究突变序列确认 |
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■ 操作流程 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
■ 实验例 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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■ 产品组份 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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■ 保存 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-20℃ |
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■ 关联资料 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Guide-it™ 突变检测试剂盒宣传页: 点击图片下载 |
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慢病毒滴度测定 p24 ELISA | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 632200 | Lenti-X p24 Rapid Titer Kit | 96 Rxns | ¥7,268 |
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p24 ELISA法测定慢病毒滴度 | |||||||||||||
· ELISA法快速简便测定病毒滴度 · 收集上清、裂解、结合、洗涤、测定 · p24衣壳蛋白质含量关联病毒滴度 |
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■ Lenti-X p24 Rapid Titer Kit通过ELISA法检测p24蛋白质快速测定慢病毒滴度。 | |||||||||||||
目前用于研究的重组慢病毒均包含主要的结构蛋白质,包括包膜蛋白质、基质蛋白质、病毒核心蛋白质。Gag基因编码病毒衣壳蛋白质(p24)、核衣壳蛋白质(p6和p7)和基质蛋白质(p17)。Clontech Lenti-X p24 Rapid Titer Kit特异性检测p24衣壳蛋白质,p24蛋白质含量与病毒滴度相关联。 | |||||||||||||
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit的操作流程是首先裂解培养基上清液中的慢病毒粒子释放p24蛋白质,然后将裂解样品添加至预包被鼠源p24抗体的检测平板中,洗涤移除未结合的裂解液,采用生物素标记的二抗、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素及显色剂检测特异结合的p24蛋白质。本试剂盒包含p24对照用于制定标准曲线。 | |||||||||||||
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慢病毒浓缩 | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 631231 | Lenti-X Concentrator | 100 ml | ¥3,064 | ||
Clontech | 631232 | Lenti-X Concentrator | 500 ml | ¥10,482 |
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提高100倍病毒滴度,无需超速离心 | |||||||||||||||||||
· 操作简便,只需与慢病毒上清液混合后离心即可 · 无需繁琐的超速离心操作 · 浓缩倍数可高达100倍,回收率可达到90% |
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Lenti-X浓缩试剂是一款无需超速离心,可简单、快速且高效地浓缩慢病毒上清液的试剂。其操作流程非常简单,只需要将慢病毒上清液与Lenti-X浓缩试剂相混合,孵育一段时间后,采用标准离心机进行离心,离心后去除上清,以1/10 - 1/100原体积液体重悬沉淀。通过以上操作可将病毒滴度最高提高约100倍。Lenti-X浓缩试剂可用于浓缩包含Clontech Lenti-X慢病毒系统制备的慢病毒在内的大多数慢病毒上清液,浓缩规模可按照需求扩大或者缩小。 | |||||||||||||||||||
■ Lenti-XTM Concentrator操作流程 | |||||||||||||||||||
■ Lenti-X Concentrator与超速离心方法比较 | |||||||||||||||||||
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■ 简便的慢病毒浓缩方法(操作方法请观看视频) | |||||||||||||||||||
■ 关联资料 | |||||||||||||||||||
Lenti-X Concentrator资料: 点击图片下载 | |||||||||||||||||||
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Capturem™ Pepsin | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 635728 | Capturem™ Pepsin | 20 Rxns | ¥3,298 |
■ 产品简介 |
蛋白质质谱分析前的样品消化步骤,通常需要4个小时甚至过夜,如果使用Capturem™ Trypsin 或 Capturem™ Pepsin,可在室温下快速,高效和完全的消化蛋白质,从而使蛋白质组学分析流程更加连贯。这两款产品是一次性小型离心柱的形式,应用新型膜技术,膜上固定有胰蛋白酶(Trypsin)或胃蛋白酶(Pepsin),在短短几分钟内即可高效、完全地酶解蛋白质样品,与传统的溶液法过夜处理相比,时间更短、效率更高、重复性更好、胰蛋白酶自溶片段更少,避免发生过度消化。 |
■ 快速、简单的操作流程 |
Capturem™ Trypsin 和 Capturem™ Pepsin包含小型离心柱和活化buffer,操作流程简单、快速,只需要加入200 μl活化buffer离心1 min,然后加入蛋白质样品再离心1 min,即可洗脱获得可用于下游分析的肽段。 |
■ 产品特点 |
·操作快速,2 min-3 min内即可酶解蛋白质样品,无需过夜处理 ·比溶液法效率更高,酶解更彻底 ·样品中自溶片段更少,蛋白质非特异性修饰几率更低 ·可以使整个蛋白质组学分析流程更加连贯,实现更有效的肽和蛋白质的质谱鉴定 |
■ 应用 |
·蛋白质鉴定 ·蛋白质组学分析 ·质谱样品制备 ·抗体鉴定 |
■ 实验例 |
使用Capturem™ Trypsin对BT474全细胞裂解液进行酶解消化并做蛋白质组学分析。通过RP-HPLC将裂解液分成19个独立的组分(图A),然后再使用Capturem™ Trypsin对每个组分单独酶解,并使用LC/MS-MS分析,每个组分中带有2个或以上的特异性肽段的蛋白质总数被鉴定并绘制出,如B图所示。 |
使用Capturem™ Trypsin可以实现快速完全的Apomyoglobin(Apo)酶解。上图为使用RP-HPLC分析Capturem™ Trypsin和常规溶液法酶解蛋白质的结果,图A为未酶解的完整蛋白质,图B为溶液法室温酶解16 h的蛋白质,图C为使用Capturem™ Trypsin酶解1 min的蛋白质,结果显示使用Capturem™ Trypsin酶解的非常彻底。 |
使用Capturem™ Trypsin可以酶解紧密折叠的蛋白质Myoglobin (Myo)。使用RP-HPLC对Capturem™ Trypsin和常规溶液法酶解的产物进行分析,图A为未酶解的完整蛋白质,图B为溶液法室温酶解16 h的蛋白质,图C为使用Capturem™ Trypsin酶解1 min的蛋白质,结果显示使用Capturem™ Trypsin可以快速有效地酶解紧密折叠的蛋白质。 |
Capturem™ Pepsin的操作流程。在酶消化之前,抗体样品被变性和还原。使用附带的活化buffer初次活化柱子后,将还原处理后的抗体样品溶液(50-800 μl)加入离心柱中,离心1分钟。 在这个过程中,柱上发生胃蛋白酶消化,随后再一次离心洗脱即可获得肽片段,加入NaOH中和洗脱的肽片段,即可用于下游分析。 |
使用Capturem™ Pepsin消化不同的小鼠抗体同种型。小鼠的IgG1, IgG2a, IgG2b, 和 IgG3各取 100 μg,使用TCEP和醋酸于75℃处理15 min进行变性操作,然后用5%甲酸buffer稀释。使用Capturem™ Pepsin对稀释的样品进行消化,通过SDS-PAGE对消化和未消化的样品(各取4 μg)进行检测,如上图所示。 |
不同批次的Capturem™ Pepsin消化产物HPLC图谱比较。使用5%的甲酸稀释50 μg的Apo,选择3个不同批次的Capturem™ Pepsin对其进行消化,HPLC结果显示三组消化产物具有相同的片段,说明Capturem™ Pepsin具有良好的重复性。 |
Capturem™ Pepsin与pepsin溶液法消化结果比较。对50 μg 的anti-HER2单克隆抗体使用3种方法进行消化,分别是Capturem™ Pepsin,pepsin溶液法孵育4小时,pepsin溶液法孵育过夜。然后进行质谱分析。由上图可以看出,使用溶液法的消化产物峰左移并且总体峰的数量较多,说明产生了过度消化,而使用Capturem™ Pepsin则没有这个问题。 |
产品详情请点击: |
上海金畔生物科技有限公司代理Takara Clontech酶试剂盒全线产品,欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
Capturem™ IP & Co-IP Kit | ||||||
品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格(元) | 说明书 | 数量 |
Clontech | 635721 | Capturem™ IP & Co-IP Kit | 12 Rxns | ¥2,623 |
基于Protein A原理的快速免疫沉淀产品 Capturem IP & Co-IP Kit |
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■ 实验原理 | |||||
Capturem Protein A 技术. 每个Capturem Protein A 纯化柱都含有高性能的改造过的Protein A 膜,表面积更大,与普通树脂相比,单位ml介质对抗体的结合能力更强。 | |||||
■ 快速纯化流程 | |||||
每个柱子最多可加入800 μl包含抗原抗体复合物的样品,然后用100 μl wash buffer洗涤, 30-50 μl elution buffer洗脱。每个步骤之间仅需1,000×g离心1 min,整个操作可在15min内完成。 | |||||
■ 与主流竞争产品提取流程对比 | |||||
与主流竞争产品相比,使用Capturem IP & Co-IP Kit能够显著缩短操作时间。 | |||||
■ 实验例 | |||||
实验例1 | |||||
与在本实验中,将NIH3T3细胞裂解液与1 μg蛋白磷酸酶2A (PP2A) B亚基抗体进行孵育,然后上样至Capturem Protein A纯化柱。用300 μl洗涤buffer洗涤后用100 μl洗脱buffer洗脱,通过凝胶电泳分离各组分,再转移到PVDF膜上,用抗PP2A B抗体探测。结果显示在洗脱液中获得了很强的PP2A B蛋白质检测信号 (52 kDa)。 注:本实验例所使用的buffer与Capturem IP & Co-IP Kit中提供的buffer不同 (参见“实验方法:使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验”)。 |
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实验方法:使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验 | |||||
将1 μg的PP2A B亚基兔多抗与NIH3T3细胞裂解液在室温下孵育10 min,同时不断颠倒混合。使用400 μl的平衡/上样 buffer(1.0 M glycine, 2 M NaCl, pH9.0)对Capturem Protein A纯化柱进行平衡,1,000×g离心1 min。将抗体-裂解复合物用裂解buffer稀释至400 μl然后上样,30×g离心4 min,再用100 μl的wash buffer (PBS) 洗涤,1,000×g 离心1 min。最后使用100 μl的elution buffer (0.1 M glycine, pH2.5)进行洗脱,收集管中预先装有10 μl的中和buffer (1 M tris,pH8.5),1,000×g离心1 min。对各组分进行凝胶电泳分离,转移到PVDF膜上,使用anti-PP2A B兔源多克隆抗体 (Cell Signaling) 进行检测。 注:实验中使用的buffer是Capturem IP & Co-IP kit中优化buffer的早期配方。 |
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实验例2 | |||||
Capturem Protein A 产品具有出色的灵活性,能兼容广泛的实验条件,可以与其他试剂盒中的IP buffer搭配使用。为了测试该性能,将NIH3T3细胞裂解液(100 μl,含有130 μg总蛋白)与0.6 μg蛋白磷酸酶2A (PP2A) B亚基抗体分别在IP kit A,IP kit B或独立的裂解Buffer C中于4℃孵育1小时,总体积为400 μl。然后分别上样至使用对应IP buffer平衡过的Capturem Protein A纯化柱,最终使用30 μl of elution buffer洗脱一次(上图. Capturem Protein A columns A1,B1,C1),为了确保充分回收抗体复合物,重复洗脱一次(上图. Capturem Protein A columns A2,B2,C2)。同时进行的还有完全使用IP kit A和IP kit B的平行实验,按照各自的实验说明进行操作(上图. IP Kit A,IP Kit B),上样量及抗体用量与Capturem组相同。 结果显示,在原始样品(OS)中存在的组分,通过免疫沉淀操作被显著的富集了。Capturem Protein A纯化柱的结果显示,在第一次洗脱时,无论使用何种IP缓冲液,PP2A B蛋白信号都很强,用低pH甘氨酸洗脱缓冲液(A1,C1)的洗脱水平最高。 注:本实验例所使用的buffer与Capturem IP & Co-IP Kit中提供的buffer不同(参见“实验方法:使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验”)。 | |||||
实验方法:测定Capturem Protein A纯化柱与不同buffer的兼容性 | |||||
将NIH3T3细胞裂解液(100 μl,含有130 μg 总蛋白质)与0.6 μg的PP2A B亚基抗体在Active Motif (A) 或Thermo Fisher Scientific (B) IP试剂盒中提供的IP buffer或者是Promega 的裂解buffer (C)中进行孵育,总体积为400 μl,于4℃孵育1 h,然后上样至使用100 μl 对应IP buffer平衡过的Capturem Protein A纯化柱,1,000×g离心1 min,100 μl wash buffer洗涤,1,000×g离心1 min,然后使用30 μl的低pH buffer(0.1 M glycine,pH2.5,A和C)或Thermo Fisher Scientific的低pH elution buffer(B)于1,000×g的条件下离心洗脱,再重复洗脱一次,以确保完全洗脱抗体复合物。与此同时,我们也分别使用Active Motif 和Thermo Fisher Scientific 的IP 试剂盒按照说明书的操作步骤单独进行了实验,起始的裂解液和抗体量与使用Capturem纯化柱相同。所有洗脱产物电泳分离后转移到PVDF膜上,使用PP2A B亚基的抗体(Cell Signaling)进行检测。 注:实验中使用的buffer是Capturem IP & Co-IP kit中优化buffer的早期配方。 |
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实验例3 | |||||
p53是一个大小为53 kDa的核磷蛋白,具有抑制肿瘤的作用,并且在DNA损伤后参与抑制细胞增殖。已知野生型p53 能与几种病毒癌基因例如SV40 T 抗原 (SV40 T) 形成特异性复合物。使用293T细胞同时表达p53和SV40 T,我们证明了使用Capturem Protein A纯化柱能在基础水平免疫共沉淀p53和SV40 T。将Anti-SV40 T抗体加入到细胞裂解液中,室温下孵育混合物20 min,并不断颠倒混合。使用Capturem IP & Co-IP Kit中的优化buffer进行IP实验,洗脱产物经电泳分离并转移至PVDF膜。然后使用p53和SV40 T的小鼠单抗进行免疫印迹检测,Capturem Protein A 对SV40 T的IP结果显示对SV40 T进行的免疫沉淀实验在洗脱产物中同时检测到了SV40 T (97 kDa) 和p53 (53 kDa)的条带,证实了二者之间较强的相互作用(上图,E-SV40 T-1和E-SV40 T-2)。
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实验方法:从293T细胞中免疫共沉淀p53和SV40 T抗原 | |||||
以同时表达p53 和SV40 T的293T细胞为样本制备细胞裂解液。向100 μg的293T细胞裂解液中加入 1 μg的SV40T抗体 (兔多抗, V-300, SCBT),室温下孵育20 min,同时不断颠倒混合。负对照组,裂解液在不加SV40 T抗体的情况下孵育,然后使用完整的Capturem IP & Co-IP Kit一式两份进行IP实验。洗脱产物电泳分离后转PVDF膜,先用SV40 T的小鼠单抗(SCBT)进行检测,剥离后再用p53的小鼠单抗进行检测(SCBT)。 |
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■ 应用 | |||||
· 免疫沉淀 · 免疫共沉淀 · 蛋白质复合物研究 · 抗体工程研究中筛选抗原 |
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产品详情请点击: | |||||