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cAMP 依赖性蛋白激酶(PKA),催化亚型 收藏
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货号 | 20300 | 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 | |
规格 | 1 mg | 价格 | 0 | |
Ex (nm) | Em (nm) | |||
分子量 | 401.27 | 溶剂 | DMSO | |
产品详细介绍 |
简要概述
产品基本信息
货号:20300
产品名称:环磷酸腺苷-AM cAMP-AM
规格:1mg
储存条件:-15℃避光防潮
保质期:24个月
产品物理化学光谱特性
分子量:401.27
溶剂:DMSO
激发波长(nm):N/A
发射波长(nm):N/A
产品介绍
cAMP-AM是可透过细胞的cAMP。经过酯酶的渗透和代谢激活后,极性cAMP释放出来,并被困在细胞内,随后迅速代谢,产生脉冲型信号。cAMP是第二种信使,用于细胞内信号转导,例如将无法通过质膜的激素(如胰高血糖素和肾上腺素)转移到细胞中。它参与蛋白激酶的活化并调节肾上腺素和胰高血糖素的作用。cAMP还结合并调节离子通道(例如HCN通道)和一些其他环状核苷酸结合蛋白(例如Epac1和RAPGEF2)的功能。
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参考文献
Induction of miR-132 and miR-212 Expression by Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1) in Rodent and Human Pancreatic beta-Cells
Authors: Shang J, Li J, Keller MP, Hohmeier HE, Wang Y, Feng Y, Zhou HH, Shen X, Rabaglia M, Soni M, Attie AD, Newgard CB, Thornberry NA, Howard AD, Zhou YP.
Journal: Mol Endocrinol (2015): 1243
Mechanisms of hydrogen sulfide (H2S) action on synaptic transmission at the mouse neuromuscular junction
Authors: Gerasimova E, Lebedeva J, Yakovlev A, Zefirov A, Giniatullin R, Sitdikova G.
Journal: Neuroscience (2015): 577
Store-operated cAMP signaling contributes to Ca2+-activated Cl- secretion in T84 colonic cells
Authors: Nichols JM, Maiellaro I, Abi-Jaoude J, Curci S, Hofer AM.
Journal: Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2015): G670
Exchange protein directly activated by cAMP mediates slow delayed-rectifier current remodeling by sustained beta-adrenergic activation in guinea pig hearts
Authors: Aflaki M, Qi XY, Xiao L, Ordog B, Tadevosyan A, Luo X, Maguy A, Shi Y, Tardif JC, Nattel S.
Journal: Circ Res (2014): 993
Prostaglandin E2 induces chloride secretion through crosstalk between cAMP and calcium signaling in mouse inner medullary collecting duct cells
Authors: Rajagopal M, Thomas SV, Kathpalia PP, Chen Y, Pao AC.
Journal: Am J Physiol Cell Physiol (2014): C263
Serotonin triggers cAMP and PKA-mediated intracellular calcium waves in Malpighian tubules of Rhodnius prolixus
Authors: Gioino P, Murray BG, Ianowski JP.
Journal: Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol (2014): R828
The nephrotoxic Ifosfamide-metabolite chloroacetaldehyde interferes with renal extracellular matrix homeostasis
Authors: Benesic A, Schwerdt G, Hennemeier I, Sauvant C, Mildenberger S, Gekle M.
Journal: Cell Physiol Biochem (2014): 1106
The secretogranin II gene is a signal integrator of glutamate and dopamine inputs
Authors: Iwase K, Ishihara A, Yoshimura S, Andoh Y, Kato M, Seki N, Matsumoto E, Hiwasa T, Muller D, Fukunaga K, Takiguchi M.
Journal: J Neurochem (2014): 233
Epac activator critically regulates action potential duration by decreasing potassium current in rat adult ventricle
Authors: Brette F, Blandin E, Simard C, Guinamard R, Salle L.
Journal: J Mol Cell Cardiol (2013): 96
Exchange protein activated by cAMP (Epac) induces vascular relaxation by activating Ca2+-sensitive K+ channels in rat mesenteric artery
Authors: Roberts OL, Kamishima T, Barrett-Jolley R, Quayle JM, Dart C.
Journal: J Physiol (2013): 5107
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货号 | 36370 | 存储条件 | 在2-8度冷藏保存, 避免光照 | |
规格 | 1 plate | 价格 | 3924 | |
Ex (nm) | 650 | Em (nm) | ||
分子量 | 溶剂 | |||
产品详细介绍 |
简要概述
腺苷3’,5’环一磷酸(cAMP)是细胞内信号转导的第二信使。检测cAMP的水平是筛选GPCR激动剂和拮抗剂的最常用方法之一。 Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下,HRP-cAMP偶联物仅与抗cAMP抗体结合。然而,测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体,因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种灵敏的方法,用于在生化或基于细胞的分析系统中检测腺苷酸环化酶的活性。与其他ELISA cAMP分析试剂盒相比,我们的试剂盒省去了繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite Green作为比色底物来定量HRP活性。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest cAMP检测试剂盒。
适用仪器
光吸收酶标仪 | |
吸收: | 405, 650, or 740nm |
推荐孔板: | 透明孔板(试剂盒自带) |
产品说明书
样品实验方案
简要概述
溶液配制
储备溶液配制
1. cAMP储备溶液(100 µM):将1 mL测定缓冲液(组分B)添加到cAMP标准品(组分A)的小瓶中。
2. HRP-cAMP共轭原液(50X):将55 µL(#36370)或550 µL(#36371)的测定缓冲液(组分B)添加到HRP-cAMP偶联物(组分C)的小瓶中。 注意:未使用的50X HRP-cAMP共轭原液应分为一次性使用的等分试样,并在-20℃下保存。
3.洗涤液(1倍):将1 mL的10X洗涤溶液(组分D)添加到9 mL蒸馏水中。
标准溶液配制
在分析缓冲液(组分B)中对cAMP标准品进行1:10、1:100和1:3的系列稀释,以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP 稀释溶液。 存放在冰箱或4°C下。
工作溶液配制
HRP-cAMP偶联物工作溶液:
在使用前,用测定缓冲液(组分B)以1:50稀释,使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意:25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点; 准备适当的体积,仅供一次性使用,现配现用。
实验步骤
1.准备样品
1.1根据需要处理细胞:
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例:吸出细胞生长培养基,在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2,37°C恒温箱,放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液,加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液(组分E),然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定,也可以在测定缓冲液(组分B)中稀释后测定。注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
1.2组织样本:
由于组织中环状核苷酸的快速代谢,重要的是在收集后快速冷冻组织(例如,使用液氮)。称重冷冻的组织,并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。
1.3尿液,血浆和培养基样品:
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1:200至1:1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1:200的稀释度测试培养基。注意:RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP测定
2.1所有测定孔均按以下顺序准备:A)cAMP标准品,对照或测试样品; B)HRP-cAMP偶联物。
2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板(组分F)的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上,在室温下孵育3小时。
2.4吸出板内容物,并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。
2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Green(组分G),并在避光的情况下在室温下孵育60分钟至3小时。
2.6使用光吸收酶标仪检测在405 nm,650 nm或740 nm处的吸光度增加。
图示
图1.使用Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒在透明的96孔板中使用SpectraMax酶标仪测量cAMP剂量反应。 可以在405 nm(蓝线),650 nm(红线)或740 nm(绿线)处读取吸光度,图B中的数据来自与Amplite Green孵育3小时的结果。 |
图2. cAMP剂量反应是通过Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒在带有SpectraMax酶标仪的透明96孔板中测量的。 A:与Amplite Green孵育1小时(蓝线)和3小时(红线)后,该试剂盒在405nm的100 µL反应体积中可检测到低至0.1 nM cAMP。 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852
Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798
Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29
The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
Authors: Almahariq M, Mei FC, Cheng X.
Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75
cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741
A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203
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货号 | 36371 | 存储条件 | 在2-8度冷藏保存, 避免光照 | |
规格 | 10 plates | 价格 | 25836 | |
Ex (nm) | 650 | Em (nm) | ||
分子量 | 溶剂 | |||
产品详细介绍 |
简要概述
腺苷3’,5’环一磷酸(cAMP)是细胞内信号转导的第二信使。检测cAMP的水平是筛选GPCR激动剂和拮抗剂的最常用方法之一。 Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下,HRP-cAMP偶联物仅与抗cAMP抗体结合。然而,测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体,因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种灵敏的方法,用于在生化或基于细胞的分析系统中检测腺苷酸环化酶的活性。与其他ELISA cAMP分析试剂盒相比,我们的试剂盒省去了繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite Green作为比色底物来定量HRP活性。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest cAMP检测试剂盒。
适用仪器
光吸收酶标仪 | |
吸收: | 405, 650, or 740nm |
推荐孔板: | 透明孔板(试剂盒自带) |
产品说明书
样品实验方案
简要概述
溶液配制
储备溶液配制
1. cAMP储备溶液(100 µM):将1 mL测定缓冲液(组分B)添加到cAMP标准品(组分A)的小瓶中。
2. HRP-cAMP共轭原液(50X):将55 µL(#36370)或550 µL(#36371)的测定缓冲液(组分B)添加到HRP-cAMP偶联物(组分C)的小瓶中。 注意:未使用的50X HRP-cAMP共轭原液应分为一次性使用的等分试样,并在-20℃下保存。
3.洗涤液(1倍):将1 mL的10X洗涤溶液(组分D)添加到9 mL蒸馏水中。
标准溶液配制
在分析缓冲液(组分B)中对cAMP标准品进行1:10、1:100和1:3的系列稀释,以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP 稀释溶液。 存放在冰箱或4°C下。
工作溶液配制
HRP-cAMP偶联物工作溶液:
在使用前,用测定缓冲液(组分B)以1:50稀释,使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意:25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点; 准备适当的体积,仅供一次性使用,现配现用。
实验步骤
1.准备样品
1.1根据需要处理细胞:
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例:吸出细胞生长培养基,在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2,37°C恒温箱,放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液,加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液(组分E),然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定,也可以在测定缓冲液(组分B)中稀释后测定。注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
1.2组织样本:
由于组织中环状核苷酸的快速代谢,重要的是在收集后快速冷冻组织(例如,使用液氮)。称重冷冻的组织,并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。
1.3尿液,血浆和培养基样品:
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1:200至1:1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1:200的稀释度测试培养基。注意:RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP测定
2.1所有测定孔均按以下顺序准备:A)cAMP标准品,对照或测试样品; B)HRP-cAMP偶联物。
2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板(组分F)的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上,在室温下孵育3小时。
2.4吸出板内容物,并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。
2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Green(组分G),并在避光的情况下在室温下孵育60分钟至3小时。
2.6使用光吸收酶标仪检测在405 nm,650 nm或740 nm处的吸光度增加。
图示
图1.使用Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒在透明的96孔板中使用SpectraMax酶标仪测量cAMP剂量反应。 可以在405 nm(蓝线),650 nm(红线)或740 nm(绿线)处读取吸光度,图B中的数据来自与Amplite Green孵育3小时的结果。 |
图2. cAMP剂量反应是通过Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒在带有SpectraMax酶标仪的透明96孔板中测量的。 A:与Amplite Green孵育1小时(蓝线)和3小时(红线)后,该试剂盒在405nm的100 µL反应体积中可检测到低至0.1 nM cAMP。 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852
Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798
Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29
The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
Authors: Almahariq M, Mei FC, Cheng X.
Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75
cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741
A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
货号 | 36373 | 存储条件 | Multiple | |
规格 | 1 plate | 价格 | 3924 | |
Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 584 | |
分子量 | 溶剂 | |||
产品详细介绍 |
简要概述
Screen Quest 荧光ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种优化的分析方法,用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的激活。该测定基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间固定数目的抗体结合位点的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下,HRP-cAMP偶联物仅与抗cAMP抗体结合。然而,测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体,因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest 荧光cAMP分析试剂盒提供了检测腺苷酸环化酶活性的灵敏方法。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比,它消除了繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite Red作为荧光HRP底物来定量HRP活性。形成的荧光产物与HRP-cAMP偶联物的活性成比例。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest cAMP检测试剂盒。
点击查看光谱
适用仪器
荧光酶标仪 | |
激发: | 540nm |
发射: | 590nm |
cutoff: | 570nm |
推荐孔板: | 黑色孔板(试剂盒自带) |
产品说明书
样品实验方案
简要概述
溶液配制
储备溶液配制
1. cAMP储备溶液(100 µM):将1 mL测定缓冲液(组分B)添加到cAMP标准品(组分A)的小瓶中。 注意:应将未使用的cAMP储备溶液(100 µM)等分并保存在-20℃下。
2. HRP-cAMP偶联物原液(50X):将55 µL(#36373)或550 µL(#36374)的测定缓冲液(组分B)添加到HRP-cAMP偶联物(组分C)的小瓶中。 注意:未使用的50X HRP-cAMP偶联物原液应分为一次性使用的等分试样,并在-20℃下保存。
3.洗涤液(1倍):将1 mL的10X洗涤溶液(组分D)添加到9 mL蒸馏水中。
4. Amplite Red储备液(200X):将50 µL(#36373)或500 µL(#36374)的DMSO加入到Amplite Red(组分G)的小瓶中。 注意:0.5 µL 200X Amplite Red储备液足以用于一个测定点。 应将未使用的再生原液分装并储存在-20℃。
工作溶液配制
1. HRP-cAMP工作溶液:在使用前,用测定缓冲液(组分B)以1:50稀释,使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意:25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点; 准备适当的体积,仅供一次性使用。
2. Amplite Red工作溶液:向10 mL底物缓冲液(组分I)中加入50 µL Amplite Red储备溶液(200X)和11.5 µL 3%H2O2(组分F)注意:Amplite Red工作溶液不稳定,请立即使用。
实验步骤
1.准备样品
1.1根据需要处理细胞:
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例:吸出细胞生长培养基,在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2,37°C恒温箱,放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液,加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液(组分E),然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定,也可以在测定缓冲液(组分B)中稀释后测定。注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
1.2组织样本:
由于组织中环状核苷酸的快速代谢,重要的是在收集后快速冷冻组织(例如,使用液氮)。称重冷冻的组织,并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。
1.3尿液,血浆和培养基样品:
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1:200至1:1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1:200的稀释度测试培养基。注意:RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP测定
2.1所有测定孔均按以下顺序准备:A)cAMP标准品,对照或测试样品; B)HRP-cAMP偶联物。
2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板(组分F)的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上,在室温下孵育2小时。
2.4吸出板内容物,并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。
2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Red工作溶液,并在避光的条件下在室温下孵育10分钟至2小时。
2.6通过使用荧光酶标仪(顶部读取模式),检测Ex / Em = 540/590 nm(截止570 nm)处的荧光增加。
图示
图1.使用Screen Quest 荧光ELISA cAMP测定试剂盒在带有Gemini酶标仪的黑色96孔板上测量cAMP剂量反应。 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852
Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798
Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29
The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
Authors: Almahariq M, Mei FC, Cheng X.
Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75
cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741
A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
货号 | 36374 | 存储条件 | Multiple | |
规格 | 10 plates | 价格 | 25836 | |
Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 584 | |
分子量 | 溶剂 | |||
产品详细介绍 |
简要概述
Screen Quest 荧光ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种优化的分析方法,用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的激活。该测定基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间固定数目的抗体结合位点的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下,HRP-cAMP偶联物仅与抗cAMP抗体结合。然而,测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体,因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest 荧光cAMP分析试剂盒提供了检测腺苷酸环化酶活性的灵敏方法。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比,它消除了繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite Red作为荧光HRP底物来定量HRP活性。形成的荧光产物与HRP-cAMP偶联物的活性成比例。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest cAMP检测试剂盒。
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适用仪器
荧光酶标仪 | |
激发: | 540nm |
发射: | 590nm |
cutoff: | 570nm |
推荐孔板: | 黑色孔板(试剂盒自带) |
产品说明书
样品实验方案
简要概述
溶液配制
储备溶液配制
1. cAMP储备溶液(100 µM):将1 mL测定缓冲液(组分B)添加到cAMP标准品(组分A)的小瓶中。 注意:应将未使用的cAMP储备溶液(100 µM)等分并保存在-20℃下。
2. HRP-cAMP偶联物原液(50X):将55 µL(#36373)或550 µL(#36374)的测定缓冲液(组分B)添加到HRP-cAMP偶联物(组分C)的小瓶中。 注意:未使用的50X HRP-cAMP偶联物原液应分为一次性使用的等分试样,并在-20℃下保存。
3.洗涤液(1倍):将1 mL的10X洗涤溶液(组分D)添加到9 mL蒸馏水中。
4. Amplite Red储备液(200X):将50 µL(#36373)或500 µL(#36374)的DMSO加入到Amplite Red(组分G)的小瓶中。 注意:0.5 µL 200X Amplite Red储备液足以用于一个测定点。 应将未使用的再生原液分装并储存在-20℃。
工作溶液配制
1. HRP-cAMP工作溶液:在使用前,用测定缓冲液(组分B)以1:50稀释,使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意:25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点; 准备适当的体积,仅供一次性使用。
2. Amplite Red工作溶液:向10 mL底物缓冲液(组分I)中加入50 µL Amplite Red储备溶液(200X)和11.5 µL 3%H2O2(组分F)注意:Amplite Red工作溶液不稳定,请立即使用。
实验步骤
1.准备样品
1.1根据需要处理细胞:
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例:吸出细胞生长培养基,在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2,37°C恒温箱,放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液,加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液(组分E),然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定,也可以在测定缓冲液(组分B)中稀释后测定。注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
1.2组织样本:
由于组织中环状核苷酸的快速代谢,重要的是在收集后快速冷冻组织(例如,使用液氮)。称重冷冻的组织,并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。
1.3尿液,血浆和培养基样品:
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1:200至1:1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1:200的稀释度测试培养基。注意:RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP测定
2.1所有测定孔均按以下顺序准备:A)cAMP标准品,对照或测试样品; B)HRP-cAMP偶联物。
2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板(组分F)的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上,在室温下孵育2小时。
2.4吸出板内容物,并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。
2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Red工作溶液,并在避光的条件下在室温下孵育10分钟至2小时。
2.6通过使用荧光酶标仪(顶部读取模式),检测Ex / Em = 540/590 nm(截止570 nm)处的荧光增加。
图示
图1.使用Screen Quest 荧光ELISA cAMP测定试剂盒在带有Gemini酶标仪的黑色96孔板上测量cAMP剂量反应。 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852
Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798
Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29
The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
Authors: Almahariq M, Mei FC, Cheng X.
Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75
cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741
A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203
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货号 | 36379 | 存储条件 | 在2-8度冷藏保存, 避免光照 |
规格 | 1 plate | 价格 | 6564 |
Ex (nm) | 390 | Em (nm) | 650 |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒提供了一种便捷的分析方法,用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的活化。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比,这种均质的cAMP分析试剂盒不需要洗涤步骤或乙酰化步骤。该测定基于荧光cAMP示踪剂和未标记的游离cAMP之间固定数目的抗cAMP抗体结合位点的竞争。游离cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中取代了荧光cAMP示踪剂。抗cAMP抗体用我们的TR Fluor Eu标记,而cAMP示踪剂包含我们的trFluor 650。在没有cAMP的情况下,trFluor 650-cAMP缀合物仅与TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合。但是,测试样品中未标记的游离cAMP竞争TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体偶联物,因此抑制了trFluor 650-cAMP与抗cAMP抗体的结合。 trFluor 650标记的cAMP示踪剂仅具有纳秒级的荧光寿命,而TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合的荧光cAMP示踪剂由于TR-FRET而具有更长的荧光寿命值。 FRET的大小与样品中cAMP的浓度成正比。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒。
适用仪器
荧光酶标仪 | |
推荐孔板: | 黑色孔板或黑色透明底板 |
使用: | 时间分辨荧光分析 |
产品说明书
样品实验方案
溶液配制
储备溶液配制
cAMP标准(1mM):将100 µL稀释剂(组分E)添加到cAMP标准品(组分C)中,并充分混合。 注意:未使用的cAMP标准液可以等分并保存在-20℃下。
工作溶液配制
1. Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液:将55 µL(#36379)或550 µL(#36380或#36381)稀释剂(组分E)添加到Anti cAMP-trFluor Eu(组分A)小瓶中。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液(组分D)中。
2. cAMP-trFluor 650工作溶液:在cAMP-trFluor 650小瓶(组分B)中加入55 µL(#36379)或550 µL(#36380或#36381)稀释剂(组分E)。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液(组分D)中。
实验步骤
1.细胞制备:
1.1对于贴壁细胞:将细胞在生长培养基中以30,000-100,000个细胞/孔在96孔板中过夜培养。
1.2对于非贴壁细胞:从培养基中离心细胞,然后将细胞沉淀以100,000-300,000个细胞/孔的速率悬浮在培养基中,在96孔板中培养。 实验前,将板以800 rpm的速度离心2分钟。
1.3根据需要处理细胞:以下是用Forskolin处理的Hela细胞在96孔板中诱导cAMP的示例。 在生长培养基中添加25 µL细胞,在Hanks中加入25 µL /孔的100 µM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2、37℃恒温箱中孵育15分钟。 注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。 细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
表1.黑色96孔板中cAMP标准品和测试样品的布局。 CS = cAMP标准(CS1-CS7); BL =空白对照; TS =测试样品。
BL | BL | TS | TS |
CS1 | CS1 | … | … |
CS2 | CS2 | … | … |
CS3 | CS3 | ||
CS4 | CS4 | ||
CS5 | CS5 | ||
CS6 | CS6 | ||
CS7 | CS7 |
表2.每个孔的试剂组成。
孔 | 容积 | 试剂 |
CS1-CS7 | 25 µL | 连续稀释 |
BL | 25 µL | 稀释剂(组分E) |
TS | 25 µL | 测试样品 |
2.细胞裂解物中的cAMP测定
2.1根据表1和表2提供的布局,准备并添加cAMP标准品(CS),空白对照(BL)和测试样品(TS)。对于384孔板,使用12.5 µL的每种相应试剂代替25 µL 。注意:测试样品可以是非刺激或刺激的样品。
2.2在cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中加入25 µL处理液(化合物重悬于缓冲液中),以使总cAMP测定体积为50 µL /孔。对于384孔板,将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中,总体积为25 µL /孔。
2.3将反应在室温下孵育30分钟。
2.4将25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液添加到cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中,使总cAMP测定体积为75 µL /孔。对于384孔板,将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中,总体积为37.5 µL /孔。注意:对于阴性对照,可以添加裂解缓冲液。
2.5将25 µL cAMP-trFluor Eu工作溶液添加到cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中,使总cAMP测定体积为100 µL /孔。对于384孔板,在每个孔中加入12.5 µL工作溶液,总体积为50 µL。
2.6将反应在室温下孵育30分钟。
2.7在兼容的TR-FRET(时间分辨荧光分析仪)上检测。
表3.方案总结
cAMP标准 |
细胞 |
||||
负控制 |
正控制 |
标准曲线 |
负控制 |
非刺激 |
刺激 |
25 µL稀释剂 |
25 µL稀释剂 |
25 µL标准液 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL化合物 |
在室温孵育30分钟 |
|||||
25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液 |
|||||
在室温孵育30分钟 |
表4.兼容的仪器汇总
制造商 | 仪器 |
Berthhold Technologies | Tristar2 S; Mithras LB 940; Mithras2 LB 943 |
Hidex | Sense; Sense Beta Plus |
Molecular Devices | Spectra Max i3X; Spectramax Paradigm; Spectramax M5e; Spectramax 3 |
Thermo Scientific | Varioskan Lux |
Biotek | Synergy Neo2; Cytation 5; Cytation 3; Synergy H1; Synergy 2 |
BMG Labtech | PHERAstar; CLARIOstar; POLARstar Omega; Fluostar Omega |
Tecan | Spark 10M; Infinite M100 Pro; Infinite F500; Infinite F200 Pro |
图示
图1.使用ClarioStar酶标仪(BMG)用Screen Quest FRET No Wash cAMP分析试剂盒测量了cAMP剂量反应。 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852
Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798
Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29
The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
Authors: Almahariq M, Mei FC, Cheng X.
Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75
cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741
A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203
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货号 | 36380 | 存储条件 | 在2-8度冷藏保存, 避免光照 |
规格 | 10 plates | 价格 | 11268 |
Ex (nm) | 390 | Em (nm) | 650 |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒提供了一种便捷的分析方法,用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的活化。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比,这种均质的cAMP分析试剂盒不需要洗涤步骤或乙酰化步骤。该测定基于荧光cAMP示踪剂和未标记的游离cAMP之间固定数目的抗cAMP抗体结合位点的竞争。游离cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中取代了荧光cAMP示踪剂。抗cAMP抗体用我们的TR Fluor Eu标记,而cAMP示踪剂包含我们的trFluor 650。在没有cAMP的情况下,trFluor 650-cAMP缀合物仅与TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合。但是,测试样品中未标记的游离cAMP竞争TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体偶联物,因此抑制了trFluor 650-cAMP与抗cAMP抗体的结合。 trFluor 650标记的cAMP示踪剂仅具有纳秒级的荧光寿命,而TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合的荧光cAMP示踪剂由于TR-FRET而具有更长的荧光寿命值。 FRET的大小与样品中cAMP的浓度成正比。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒。
适用仪器
荧光酶标仪 | |
推荐孔板: | 黑色孔板或黑色透明底板 |
分析方法: | 时间分辨荧光分析 |
产品说明书
样品实验方案
溶液配制
储备溶液配制
cAMP标准(1mM):将100 µL稀释剂(组分E)添加到cAMP标准品(组分C)中,并充分混合。 注意:未使用的cAMP标准液可以等分并保存在-20℃下。
工作溶液配制
1. Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液:将55 µL(#36379)或550 µL(#36380或#36381)稀释剂(组分E)添加到Anti cAMP-trFluor Eu(组分A)小瓶中。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液(组分D)中。
2. cAMP-trFluor 650工作溶液:在cAMP-trFluor 650小瓶(组分B)中加入55 µL(#36379)或550 µL(#36380或#36381)稀释剂(组分E)。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液(组分D)中。
实验步骤
1.细胞制备:
1.1对于贴壁细胞:将细胞在生长培养基中以30,000-100,000个细胞/孔在96孔板中过夜培养。
1.2对于非贴壁细胞:从培养基中离心细胞,然后将细胞沉淀以100,000-300,000个细胞/孔的速率悬浮在培养基中,在96孔板中培养。 实验前,将板以800 rpm的速度离心2分钟。
1.3根据需要处理细胞:以下是用Forskolin处理的Hela细胞在96孔板中诱导cAMP的示例。 在生长培养基中添加25 µL细胞,在Hanks中加入25 µL /孔的100 µM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2、37℃恒温箱中孵育15分钟。 注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。 细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
表1.黑色96孔板中cAMP标准品和测试样品的布局。 CS = cAMP标准(CS1-CS7); BL =空白对照; TS =测试样品。
BL | BL | TS | TS |
CS1 | CS1 | … | … |
CS2 | CS2 | … | … |
CS3 | CS3 | ||
CS4 | CS4 | ||
CS5 | CS5 | ||
CS6 | CS6 | ||
CS7 | CS7 |
表2.每个孔的试剂组成。
孔 | 容积 | 试剂 |
CS1-CS7 | 25 µL | 连续稀释 |
BL | 25 µL | 稀释剂(组分E) |
TS | 25 µL | 测试样品 |
2.细胞裂解物中的cAMP测定
2.1根据表1和表2提供的布局,准备并添加cAMP标准品(CS),空白对照(BL)和测试样品(TS)。对于384孔板,使用12.5 µL的每种相应试剂代替25 µL 。注意:测试样品可以是非刺激或刺激的样品。
2.2在cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中加入25 µL处理液(化合物重悬于缓冲液中),以使总cAMP测定体积为50 µL /孔。对于384孔板,将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中,总体积为25 µL /孔。
2.3将反应在室温下孵育30分钟。
2.4将25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液添加到cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中,使总cAMP测定体积为75 µL /孔。对于384孔板,将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中,总体积为37.5 µL /孔。注意:对于阴性对照,可以添加裂解缓冲液。
2.5将25 µL cAMP-trFluor Eu工作溶液添加到cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中,使总cAMP测定体积为100 µL /孔。对于384孔板,在每个孔中加入12.5 µL工作溶液,总体积为50 µL。
2.6将反应在室温下孵育30分钟。
2.7在兼容的TR-FRET(时间分辨荧光分析仪)上检测。
表3.方案总结
cAMP标准 |
细胞 |
||||
负控制 |
正控制 |
标准曲线 |
负控制 |
非刺激 |
刺激 |
25 µL稀释剂 |
25 µL稀释剂 |
25 µL标准液 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL化合物 |
在室温孵育30分钟 |
|||||
25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液 |
|||||
在室温孵育30分钟 |
表4.兼容的仪器汇总
制造商 | 仪器 |
Berthhold Technologies | Tristar2 S; Mithras LB 940; Mithras2 LB 943 |
Hidex | Sense; Sense Beta Plus |
Molecular Devices | Spectra Max i3X; Spectramax Paradigm; Spectramax M5e; Spectramax 3 |
Thermo Scientific | Varioskan Lux |
Biotek | Synergy Neo2; Cytation 5; Cytation 3; Synergy H1; Synergy 2 |
BMG Labtech | PHERAstar; CLARIOstar; POLARstar Omega; Fluostar Omega |
Tecan | Spark 10M; Infinite M100 Pro; Infinite F500; Infinite F200 Pro |
图示
图1.使用ClarioStar酶标仪(BMG)用Screen Quest FRET No Wash cAMP分析试剂盒测量了cAMP剂量反应。 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852
Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798
Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29
The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
Authors: Almahariq M, Mei FC, Cheng X.
Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75
cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741
A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
货号 | 36381 | 存储条件 | 避免光照, 在2-8度冷藏保存 |
规格 | 50 plates | 价格 | 46344 |
Ex (nm) | 390 | Em (nm) | 650 |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒提供了一种便捷的分析方法,用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的活化。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比,这种均质的cAMP分析试剂盒不需要洗涤步骤或乙酰化步骤。该测定基于荧光cAMP示踪剂和未标记的游离cAMP之间固定数目的抗cAMP抗体结合位点的竞争。游离cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中取代了荧光cAMP示踪剂。抗cAMP抗体用我们的TR Fluor Eu标记,而cAMP示踪剂包含我们的trFluor 650。在没有cAMP的情况下,trFluor 650-cAMP缀合物仅与TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合。但是,测试样品中未标记的游离cAMP竞争TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体偶联物,因此抑制了trFluor 650-cAMP与抗cAMP抗体的结合。 trFluor 650标记的cAMP示踪剂仅具有纳秒级的荧光寿命,而TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合的荧光cAMP示踪剂由于TR-FRET而具有更长的荧光寿命值。 FRET的大小与样品中cAMP的浓度成正比。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒。
适用仪器
荧光酶标仪 | |
推荐孔板: | 黑色孔板或黑色透明底板 |
使用 | 时间分辨荧光分析 |
产品说明书
样品实验方案
溶液配制
储备溶液配制
cAMP标准(1mM):将100 µL稀释剂(组分E)添加到cAMP标准品(组分C)中,并充分混合。 注意:未使用的cAMP标准液可以等分并保存在-20℃下。
工作溶液配制
1. Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液:将55 µL(#36379)或550 µL(#36380或#36381)稀释剂(组分E)添加到Anti cAMP-trFluor Eu(组分A)小瓶中。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液(组分D)中。
2. cAMP-trFluor 650工作溶液:在cAMP-trFluor 650小瓶(组分B)中加入55 µL(#36379)或550 µL(#36380或#36381)稀释剂(组分E)。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液(组分D)中。
实验步骤
1.细胞制备:
1.1对于贴壁细胞:将细胞在生长培养基中以30,000-100,000个细胞/孔在96孔板中过夜培养。
1.2对于非贴壁细胞:从培养基中离心细胞,然后将细胞沉淀以100,000-300,000个细胞/孔的速率悬浮在培养基中,在96孔板中培养。 实验前,将板以800 rpm的速度离心2分钟。
1.3根据需要处理细胞:以下是用Forskolin处理的Hela细胞在96孔板中诱导cAMP的示例。 在生长培养基中添加25 µL细胞,在Hanks中加入25 µL /孔的100 µM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2、37℃恒温箱中孵育15分钟。 注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。 细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
表1.黑色96孔板中cAMP标准品和测试样品的布局。 CS = cAMP标准(CS1-CS7); BL =空白对照; TS =测试样品。
BL | BL | TS | TS |
CS1 | CS1 | … | … |
CS2 | CS2 | … | … |
CS3 | CS3 | ||
CS4 | CS4 | ||
CS5 | CS5 | ||
CS6 | CS6 | ||
CS7 | CS7 |
表2.每个孔的试剂组成。
孔 | 容积 | 试剂 |
CS1-CS7 | 25 µL | 连续稀释 |
BL | 25 µL | 稀释剂(组分E) |
TS | 25 µL | 测试样品 |
2.细胞裂解物中的cAMP测定
2.1根据表1和表2提供的布局,准备并添加cAMP标准品(CS),空白对照(BL)和测试样品(TS)。对于384孔板,使用12.5 µL的每种相应试剂代替25 µL 。注意:测试样品可以是非刺激或刺激的样品。
2.2在cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中加入25 µL处理液(化合物重悬于缓冲液中),以使总cAMP测定体积为50 µL /孔。对于384孔板,将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中,总体积为25 µL /孔。
2.3将反应在室温下孵育30分钟。
2.4将25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液添加到cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中,使总cAMP测定体积为75 µL /孔。对于384孔板,将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中,总体积为37.5 µL /孔。注意:对于阴性对照,可以添加裂解缓冲液。
2.5将25 µL cAMP-trFluor Eu工作溶液添加到cAMP标准品,空白对照和测试样品的每个孔中,使总cAMP测定体积为100 µL /孔。对于384孔板,在每个孔中加入12.5 µL工作溶液,总体积为50 µL。
2.6将反应在室温下孵育30分钟。
2.7在兼容的TR-FRET(时间分辨荧光分析仪)上检测。
表3.方案总结
cAMP标准 |
细胞 |
||||
负控制 |
正控制 |
标准曲线 |
负控制 |
非刺激 |
刺激 |
25 µL稀释剂 |
25 µL稀释剂 |
25 µL标准液 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL化合物 |
在室温孵育30分钟 |
|||||
25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液 |
|||||
在室温孵育30分钟 |
表4.兼容的仪器汇总
制造商 | 仪器 |
Berthhold Technologies | Tristar2 S; Mithras LB 940; Mithras2 LB 943 |
Hidex | Sense; Sense Beta Plus |
Molecular Devices | Spectra Max i3X; Spectramax Paradigm; Spectramax M5e; Spectramax 3 |
Thermo Scientific | Varioskan Lux |
Biotek | Synergy Neo2; Cytation 5; Cytation 3; Synergy H1; Synergy 2 |
BMG Labtech | PHERAstar; CLARIOstar; POLARstar Omega; Fluostar Omega |
Tecan | Spark 10M; Infinite M100 Pro; Infinite F500; Infinite F200 Pro |
图示
图1.使用ClarioStar酶标仪(BMG)用Screen Quest FRET No Wash cAMP分析试剂盒测量了cAMP剂量反应。 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852
Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798
Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29
The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
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Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741
A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
货号 | 36382 | 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 | |
规格 | 100 Tests | 价格 | 17748 | |
Ex (nm) | 490 | Em (nm) | 520 | |
分子量 | 溶剂 | |||
产品详细介绍 |
简要概述
产品基本信息
货号:36382
产品名称:Screen Quest 活细胞cAMP检测
规格:100 Tests
产品介绍
G蛋白偶联受体(GPCR)是药物发现计划中最大的靶向受体之一。钙通量(通过Gq途径耦合)分析是筛选GPCR靶点的首选方法。然而,超过60%的已知GPCRs信号通过腺苷酸环化酶活性偶联到cAMP。现有的cAMP检测方法不仅需要细胞裂解,而且缺乏时间和空间分辨率。Screen Quest 活细胞cAMP检测以高通量的形式提供细胞内cAMP变化的实时监测,无需细胞裂解步骤。该方法通过含有外源性环核苷酸门控通道(CNGC)或混杂G蛋白Gα16的细胞系进行。该通道被细胞内cAMP水平升高激活,导致离子通量和细胞膜去极化,可通过荧光钙(如Calbryte 520 AM、Cal-520 AM、Fluo-8 AM或Fluo-4 AM和相应的免洗钙试剂盒)或荧光膜电位染料检测到。Gα16与特异性非Gq偶联受体的共表达将在受体刺激下产生细胞内钙信号。Screen Quest 活细胞cAMP检测提供细胞系和试剂,用于使用FLIPR、FDSS或其他等效的荧光酶标仪检测细胞内cAMP的变化。它已成功地用于测定Gs和Gi偶联GPCR活性。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest 活细胞cAMP检测。
图示
图1. Screen Quest 活细胞cAMP测定原理 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
Journal: Int J Mol Sci (2016): 852
Odor-induced cAMP production in Drosophila melanogaster olfactory sensory neurons
Authors: Miazzi F, Hansson BS, Wicher D.
Journal: J Exp Biol (2016): 1798
Role of the cAMP Pathway in Glucose and Lipid Metabolism
Authors: Ravnskjaer K, Madiraju A, Montminy M.
Journal: Handb Exp Pharmacol (2016): 29
The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
Authors: Almahariq M, Mei FC, Cheng X.
Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75
cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
Authors: Rodriguez P, Rojas J.
Journal: J Cell Biochem (2016): 741
A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
Authors: Vedel L, Brauner-Osborne H, Mathiesen JM.
Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203