NEBNext 酶学转化法甲基化建库相关产品

NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒

NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块

NEBNext Q5U™ 预混液

NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物）

虽然重亚硫酸盐测序是研究 DNA 甲基化的金标准，但这种转化方式会对DNA 造成损伤，导致 DNA 断裂、丢失和 GC 偏嗜。NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 (EM-seq^™) 提供了一种酶学方法代替全基因组重亚硫酸盐处理 DNA (WGBS) 的方法，并结合高效流程化的建库步骤，适用于 Illumina 平台测序。高效的 EM-Seq 酶促转化可最大程度地减少对DNA的损伤，结合提供的 NEBNext Ultra II 文库制备流程，最终产生的高质量文库可以从有限的测序数据中更灵敏的检测到 5-mC 和 5-hmC。

更卓越的 5-mC 和 5-hmC 检测灵敏度

更高的比对率

更均一的 GC 覆盖度

能从有限的测序数据检测到更多的 CpG 位点

更均一的二核苷酸分布

更长的文库插入片段

更高效的建库流程

提供转化模块

EM-Seq 能得到更高的文库产量。采用Covaris S2 仪器将 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。上述所有起始量，EM-Seq 都能使用更少的 PCR 循环得到更高的文库产量，表明 EM-Seq 显著减少了 WGBS 方法中的 DNA 损失。误差条表示标准差。

NEBNext 酶学转化法甲基化文库可获得更长的插入片段 。采用Covaris^® S2 仪器将 50 ng 人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold^™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina MiSeq (2 X 76 bases) 测序，片段大小采用 Picard 2.18.14 测定。图中绘制了每个插入片段出现的频率标准化后的数据，结果如图：EM-Seq 建库后的插入片段比 WGBS 方法得到的插入片段更长，说明：酶学转化法不会对 DNA 造成损伤，而重亚硫酸盐处理的 DNA 有严重损伤。

A: CpG 位点检测：通过分析 3.24 亿双端数据得到 EM-Seq 和 WGBS 文库的 CpG 位点覆盖度，其中每条链都独立计数，最终得到最多 5600 万个可能的 CpG 位点。结果显示：EM-Seq 在更低测序深度能检测到更多的 CpG 位点。

B: GC 覆盖度：使用 Picard 2.17.2 计算 GC 覆盖度，图中显示不同 GC 含量时 (0-100%)，标准化后覆盖度的分布情况。结果显示：EM-Seq 文库显著提高 GC 覆盖度的均一性，无 AT 过度测序，也无 GC 测序不足，后两项都是 WGBS 文库的典型缺陷。

图中显示了 EM-Seq 和 WGBS 两种方法在不同起始量，至少 1X 和 8X 测序深度下检测到的独有和共有的 CpG 位点。EM-Seq 在至少 1X 测序深度下比 WGBS 多检测到 20% 以上的 CpG 位点。而在至少 8X 测序深度下，CpG 位点覆盖度差异增加至 2 倍。

NEBNext FFPE DNA 修复混合液

NEBNext Ultra II 末端修复/加 dA 尾模块

NEBNext 快速连接模块

 NEBNext^®-Oxford Nanopore Technologies^® 连接测序配套试剂（E7180）包含以下三个 Oxford Nanopore Technologies 连接测序文库制备推荐模块：NEBNext FFPE DNA 修复混合液（M6630）、NEBNext Ultra II 末端修复/加 dA 尾模块（E7546）和 NEBNext 快速连接模块（E6056）。现在您可更方便地通过同一个货号 E7180 订购以上所有模块，并且该产品已为 Oxford Nanopore Technologies 连接测序试剂盒（SQK-LSK109）优化了体积。

 为连接测序试剂盒（SQK-LSK109）进行了组份体积的优化

更简化的订购和库存管理

适用于所有 Nanopore 测序仪：Minion^®、Gridion^®、Promethion^®、Floungle^®

杜绝浪费——没有多余的缓冲液或过量的试剂

 该模块包含了以下试剂，并已为 Oxford Nanopore Technologies 连接测序试剂盒（SQK-LSK109）优化了体积：

NEBNext^® FFPE DNA 修复混合液（0.048 ml）

NEBNext^® FFPE DNA 修复缓冲液（0.084 ml）

NEBNext^® Ultra™ II 末端修复酶混合液（0.072 ml）

NEBNext^® Ultra™ II 末端修复反应缓冲液（0.084 ml）

快速 T4 连接酶（0.024 ml）

 使用这些试剂时，请遵循 Oxford Nanopore Technologies 相应设备连接测序试剂盒（SQK-LSK109）的操作手册。

NEBNext^® rRNA 去除试剂盒 v2（人/小鼠/大鼠）- 含 RNA 纯化磁珠

· 高效去除人、小鼠、大鼠 RNA 中的 rRNA

 高丰度的核糖体 RNAs（rRNAs）占总 RNA 的 80-90%，进行二代测序和其它应用前需要在上游实验中将其去除。NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2 优化了试剂、探针和操作手册，去除效果更卓越。基于 RNAse-H 的高效工作流程和紧密的探针间距，能高效地从低质量和高质量 RNA 中去除 rRNA，针对广泛的起始量范围亦同样有效。

从不同起始量的人、小鼠、大鼠样品中，NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2 均能高效富集目的 RNAs。使用 NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2（人/小鼠/大鼠）从人、小鼠和大鼠通用参考总 RNA（1 µg、100 ng 和 10 ng）中去除 rRNA。使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 定向文库制备试剂盒制备文库，并进行 Illumina 双端测序（2 x 75 bp）。从每个文库中抽取（seqtk）1000 万个 Reads，并使用 Mirabait（6 个或更多，25-mers）鉴定去除文库中的 rRNA 残留，人 rRNA 探针取自 5S、5.8S、12S、16S、18S、28S、ETS/ITS；小鼠/大鼠 rRNA 探针取自 5S、5.8S、12S、16S、18S、28S。残留的 rRNA 水平是通过将匹配上的 Reads 数除以质控过滤后的总 Reads 数计算得出。数据代表 3 次重复的平均值。结果表明：从不同起始量的人、小鼠、大鼠样品中，NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2 均能高效去除 rRNA。

使用 NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2，不会影响目的转录本的丰度。使用 NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2（人/小鼠/大鼠）从人、小鼠和大鼠通用参考总 RNA（1 µg）中去除 rRNA。使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 定向文库制备试剂盒分别对去除后和未去除的 RNA 制备文库，并进行 Illumina 双端测序（2 x 75 bp）。从去除后的文库中抽取（seqtk）1000 万个 Reads，从未去除的文库中抽取 1 亿个 Reads。使用 Salmon 计算 GENCODE v27 转录本的丰度。图中显示了线性拟合的 Read 计数和 R2 值。结果表明：测试的所有物种去除 rRNA 后转录表达水平与未去除文库一致。

不同起始量情况下，样本文库之间都保持一致的转录表达相关性。使用 NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2（人/小鼠/大鼠）从人、小鼠和大鼠通用参考总 RNA（1 µg）中去除 rRNA。使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 定向文库制备试剂盒制备文库，并进行 Illumina 双端测序（2 x 75 bp）。使用 Salmon 计算 GENCODE v27 转录本的丰度。图中显示了线性拟合的 Read 计数和 R2 值。结果表明：测试的所有起始量转录表达相关性保持一致。

NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2 在保证转录本丰度的同时，能有效地从降解的 FFPE 总 RNA 中去除 rRNA。使用 NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2（人/小鼠/大鼠）（A、B、C）和 TruSeq® Stranded Total RNA Gold Kit（A）从成人正常肝组织 FFPE 总 RNA（RIN 2.3，100 ng 和 10 ng）中去除 rRNA。使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 定向文库制备试剂盒制备文库，并进行 Illumina 双端测序（2 x 75 bp）。从去除后的文库中抽取（seqtk）2000 万个 Reads，从未去除的文库中抽取 2 亿个 Reads。图（A）使用 Mirabait（6 个或更多，25-mers）鉴定去除文库中的 rRNA 残留，人 rRNA 探针取自 5S、5.8S、12S、16S、18S、28S、ETS/ITS。残留的 rRNA 水平是通过将匹配上的 Reads 数除以质控过滤后的总 Reads 数计算得出。数据代表 3 次重复的平均值，误差条表示标准差。（B）和（C）使用 Salmon 计算 GENCODE v27 转录本的丰度。图中显示了线性拟合的 Read 计数和 R2 值。结果表明：NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2（人/小鼠/大鼠）能从 FFPE（降解的）样本中高效去除 rRNA，并可灵活应用于低起始量，且在不同起始量情况下，去除后的转录表达相关性也保持一致。

 血液样本中绝大部分的 RNA 由珠蛋白（Globin）mRNA 以及细胞质和线粒体核糖体 RNA（rRNA）组成。这些高丰度的 RNA 会掩盖低丰度转录本的生物学意义，因此，高效、特异性地去除这些 RNA 是至关重要的。

NEBNext® RNA 去除核心试剂 – 含 RNA 纯化磁珠

 RNAse-H 的高效工作流程结合在线工具设计的紧密间距探针，无论 RNA 质量高低，无论 RNA 起始量多少，都能高效去除 rRNA

·   ·使用 NEBNext® Custom RNA Depletion Design Tool 设计的探针序列，可从任意物种中去除不需要的 RNA

·   ·起始量范围广：10 ng – 1 μg

·   · 同时适用于低质量和高质量 RNA 样本

·   · 超快速工作流程：仅需 2 小时，手动操作时间少于 10 分钟

·   · 可提供 RNAClean® 磁珠

 在 RNA-seq 中，高丰度转录本如核糖体 RNA（rRNA）会占据绝大部分测序数据，但它的生物学意义极低，并会掩盖那些具有真正生物学意义的低丰度转录本的检测。当某种样品没有相应的 RNA 去除试剂盒时，这一挑战变的更为严峻。NEBNext® RNA 去除核心试剂提供客户定制，可以从任意物种中去除不需要的 RNA，探针设计工具操作简单方便（NEBNext® Custom RNA Depletion Design Tool）。

 通过联合使用 NEB 提供的 NEBNext® RNA 去除核心试剂和客户自行设计定制的探针，去除不需要的 RNA，工作流程如下：

第一步：使用在线的 NEBNext® Custom RNA Depletion Design Tool，输入目标 RNA 序列，获得定制的探针序列。

第二步：从您信任的供应商处订购 ssDNA 寡核苷酸探针。

第三步：探针与 NEBNext® 定制 RNA 去除核心试剂一起使用，或与其它 NEBNext® RNA 去除试剂盒联合使用。

不同起始量、不同物种的样本，NEBNext® 定制 RNA 去除试剂盒均能高效去除目标 RNA，富集目的 RNAs。使用 NEBNext® Custom RNA Depletion Design Tool 针对埃及伊蚊、超嗜热原始菌和激烈火球菌的 rRNA 设计探针。使用 RNA 去除核心试剂盒和设计的探针从 1 µg、100 ng 和 10 ng 总 RNA 中去除 rRNA。使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 定向文库制备试剂盒制备文库，并进行 Illumina 双端测序（2 x 75 bp）。从每个文库中抽取（seqtk）2000 万个 Reads。使用 Mirabait（6 个或更多，25-mers）鉴定 rRNA，残留的 rRNA 水平是通过将匹配上的 Reads 数除以质控过滤后的总 Reads 数计算得出。数据代表 3 次重复的平均值。结果表明：不同起始量（1 µg – 10 ng）、不同物种的样本，NEBNext® 定制 RNA 去除方法均能高效去除目标 RNA。

使用 NEBNext® 定制 RNA 去除试剂盒去除目标 RNA，不会影响目的转录本的丰度。使用 NEBNext® Custom RNA Depletion Design Tool 针对埃及伊蚊的 rRNA 设计探针。埃及伊蚊成虫（Benzon Research）。使用 Monarch® 总 RNA 小量提取试剂盒（NEB #T2010S）从埃及伊蚊成虫（Benzon Research）中提取总 RNA。使用 RNA 去除核心试剂盒和设计的探针从 100 ng 和 10 ng 总 RNA 中去除 rRNA。使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 定向文库制备试剂盒制备文库，并进行 Illumina 双端测序（2 x 75 bp）。从去除后的文库中抽取（seqtk）2000 万个 Reads，从未去除的文库中抽取 2 亿个 Reads。使用 Salmon 和来自 Vectorbase（AaegL5.2 assembly）的转录本计算转录本的丰度。图中显示了线性拟合的 Read 计数和 R² 值。图 A 表明：去除不影响目的转录本的丰度。图 B 表明：不同起始量在多次重复实验中转录本丰度保持一致。

组合探针能有效去除人 rRNA 和线粒体 mRNA。使用 NEBNext® Custom RNA Depletion Design Tool 针对人线粒体 mRNA 设计探针。设计的探针与 NEBNext® rRNA 去除试剂盒 v2（人/小鼠/大鼠）的探针组合使用。使用组合探针从 1 µg 人通用参考总 RNA（Agilent®）中去除线粒体 RNA 和 rRNA。使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 定向文库制备试剂盒制备文库，并进行 Illumina 双端测序（2 x 75 bp）。从每个文库中抽取（seqtk）2000 万个 Reads。图（A）使用 Mirabait（6 个或更多，25-mers）鉴定 rRNA 和线粒体 RNA，残留的 rRNA 和 mtRNA 水平是通过将匹配上的 Reads 数除以质控过滤后的总 Reads 数计算得出。rRNA 和线粒体 RNA 都被有效地去除。图 B 中 IGV 图显示了人类线粒体基因上的覆盖度。

NEBNext Direct® 基因分型解决方案靶向富集试剂盒

 NEBNext Direct® 基因分型解决方案具有低成本高效益、高通量等特点，通过对靶基因测序进行基因分型，可广泛应用于植物、动物和人类。

 适用于几百到几千个 Marker 基因分型的理想解决方案

 使用 SolCAP 公开提供的 2,309 个 Marker Panel 对 96 个番茄 DNA 样本进行富集，并结合 NEBNext Direct^® 基因分型解决方案试剂盒做基因分型。图中显示了质控后的 Reads 数。每个样本起始量为 25 ng 纯化的番茄 DNA。样本加上标签标记后再进行杂交，文库在 Illumina^® Miseq^® 上测序，并设置程序：12 个碱基的唯一分子标签和 8 个碱基的样本标签用 Read 1 运行 20 个循环，目标基因用 Read 2 运行 75 个循环。

图中显示了 96 个样本 2,309 个 SolCAP Markers 的平均 SNP 覆盖度。每个样本起始量为 25 ng 纯化的番茄 DNA。样本加上标签标记后再进行杂交，文库在 Illumina^® Miseq^® 上测序，并设置程序：12 个碱基的唯一分子标签和 8 个碱基的样本标签用 Read 1 运行 20 个循环，目标基因用 Read 2 运行 75 个循环。结果表明：NEBNext Direct^® 基因分型解决方案在 96 个样本中显示了相似的覆盖度。

NEBNext Direct^® 基因分型解决方案对 96 个样本富集的特异性

 

 

图中显示了质控后的 Reads 数比对到目标区域的百分比，表明 NEBNext^® Direct 基因分型解决方案在 96 个样本中都显示出高度特异性。每个样本起始量为 25 ng 纯化的番茄 DNA。样本加上标签标记后再进行杂交，文库在 Illumina^® Miseq^® 上测序，并设置程序：12 个碱基的唯一分子标签和 8 个碱基的样本标签用 Read 1 运行 20 个循环，目标基因用 Read 2 运行 75 个循环。

单个样本中 2,309 个 Marker 的平均覆盖度

 

2,309 个 SolCAP Markers 覆盖度的柱状图显示了目标富集和覆盖水平的均一性，该结果足以进行基因分型。这些数据来自与其它 95 个番茄样本混合杂交后的一个番茄样本。样本起始量为 25 ng 纯化的番茄 DNA。样本加上标签标记后再进行杂交，文库在 Illumina® Miseq® 上测序，并设置程序：12 个碱基的唯一分子标签和 8 个碱基的样本标签用 Read 1 运行 20 个循环，目标基因用 Read 2 运行 75 个循环。

NEBNext Ultra II Q5^® 预混液

NEBNext Q5 高保真热启动 PCR 预混液

NEBNext  超保真 2X PCR 预混液专门针对二代测序文库制备中的 PCR 扩增反应进行了优化，不论 GC 含量多少，该产品都能够进行稳定、高保真的扩增。特殊的预混液中包含了错配率极低的 Q5 超保真 DNA 聚合酶、优化的缓冲液和反应增强剂，适合大多数模板的扩增，包括高 GC 含量的模板。该预混液的缓冲液组份针对高 GC 含量的模板甚至是二代测序文库都可提供超强的扩增。在二代测序文库制备时，NEBNext  超保真 2X PCR 预混液是您的最佳选择。 

无核酸内、外切酶污染 

50 μl 的反应体系，加入 NEBNext  超保真2X  PCR  预混液、DNA  模板和  0.5  μM  到  1.25  μM  的引物（取决于样本起始量）。 

请登陆 NEBNextSelector.neb.com 可以使用在线产品选择工具进行产品选择。