标签归档：流式细胞

Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒 货号36310-AAT Bioquest荧光染料

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。

Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒

Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒

Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒 货号36310 货号 36310 存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格 100 Tests 价格 6564
Ex (nm) 493 Em (nm) 515
分子量 溶剂
产品详细介绍

简要概述

Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒提供了基于荧光的测定法，用于使用流式细胞仪检测细胞内钙动员。它可以用于动力学读数或终点读数。将Calbryte 520 AM染料加载到细胞中后，只需洗涤细胞并添加钙通量激动剂，即可通过流式细胞仪使用动力学读取模式或终点读取模式读取样品。 Calbryte 520 AM可以通过扩散被动地穿过细胞膜。一旦进入细胞内部，Calbryte 520 AM的亲脂性封闭基团就会被酯酶裂解，产生带负电荷的荧光染料，并留在细胞内部。与钙结合后，其荧光大大增强。当用激动剂刺激表达目的GPCR的细胞时，受体会发出释放细胞内钙的信号，这会明显增加Calbryte 520的荧光。Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒也可用于检测细胞钙通量作为细胞分选。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒。

点击查看光谱

 

适用仪器

流式细胞仪  
激发: 488nm激光
发射: 530/30nm滤波片
通道： FITC通道
其他可用仪器：
FDSS, ViewLux, NOVOStar, ArrayScan, FlexStation, IN Cell Analyzer

产品说明书

样品实验方案

简要概述

  1. 在测定缓冲液中准备细胞
  2. 添加Calbryte 520 AM染料加载溶液（1 µL）
  3. 在37°C孵育30分钟
  4. 清洗细胞
  5. 添加钙通量激动剂
  6. 在530/30 nm滤光片（FITC通道）使用流式细胞仪检测荧光强度

 

溶液配制

储备溶液配制

Calbryte 520 AM储备溶液（500X）：在Calbryte 520 AM储备溶液（组分A）的小瓶中加入100 µL DMSO（未提供），并充分混合。 注意：100 µL Calbryte 520 AM储备溶液足以进行100次测定。 如果试管密封严密，可以将未使用的Calbryte 520 AM原液分装并在<-20°C下保存超过一个月。 避光并避免重复的冻融循环。

  

实验步骤

1.除去细胞培养基，并加入0.5 mL测定缓冲液。注意：对于贴壁细胞和非贴壁细胞，建议分别使用4 x 105 – 8 x 105和1 x 106-2 X 106。每个细胞系应根据个体情况进行评估，以确定细胞内钙动员的最佳细胞密度。

2.将1µL Calbryte 520 AM储备溶液（500X）加到0.5 mL非标准或贴壁细胞的测定缓冲液（组分B）中。注意：如果细胞（例如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，则可将丙磺舒（组分C）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度将为0.125-1 mM），以减少去离子水的泄漏。

3.将细胞在37°C下孵育30分钟。

4.对于非贴壁细胞，将细胞离心并去除染料。将细胞重悬于0.4 mL HHBS（组分D）中。对于贴壁细胞，使用0.5 mM EDTA轻轻地将细胞从板中提起并离心。将细胞重悬于0.4 mL HHBS（组分D）中。注意：要从板上分离贴壁细胞，可以考虑使用酶试剂（例如胰蛋白酶，Accutase），但需要进行测试以确保细胞表面上的目标受体不受影响。

5.用HHBS或所需的缓冲液制备5X激动剂化合物。

6.使用530/30 nm滤光片（FITC通道）在流式细胞仪上检测，在添加100 µL制备的激动剂之前和之后分析样品。注意：为获得最佳结果，重要的是在添加激动剂后1分钟内进行测定。确保激动剂添加到实际读数开始之间的时间对于所有样品保持恒定。

 

图示

 

 

Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒 货号36310

图1.通过Cell Meter 流式细胞钙测定试剂盒在CHO-K1细胞中测量了ATP诱导的细胞内钙释放。将细胞与Calbryte 520 AM染料在37°C下孵育30分钟，然后向细胞中添加10μM的ATP， 在加入ATP后，获得基线并分析其余细胞。这种反应是随着时间的推移而测量的。分析在NovoCyte 3000流式细胞仪上进行。图表上的箭头表示添加ATP和实际分析之间的时间（30秒）。
Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒 货号36310

通过Cell Meter 流式细胞钙测定试剂盒在CHO-K1细胞中测量了ATP诱导的细胞内钙释放。将细胞与Calbryte 520 AM染料在37°C下孵育30分钟，然后向细胞中添加10μM的ATP， 在加入ATP后，获得基线并分析其余细胞。这种反应是随着时间的推移而测量的。分析在NovoCyte 3000流式细胞仪上进行。图表上的箭头表示添加ATP和实际分析之间的时间（30秒）。B.荧光信号随时间的变化。

 

 

相关产品

Fluorescence absorbance inner-filter decomposition: the role of emission shape on estimates of free Ca(2+) using Rhod-2
Authors: Territo PR, Heil J, Bose S, Evans FJ, Balaban RS.
Journal: Appl Spectrosc (2007): 138

Kinetic characterization of novel NR2B antagonists using fluorescence detection of calcium flux
Authors: Bednar B, Cunningham ME, Kiss L, Cheng G, McCauley JA, Liverton NJ, Koblan KS.
Journal: J Neurosci Methods (2004): 247

Novel fluo-4 analogs for fluorescent calcium measurements
Authors: Martin VV, Beierlein M, Morgan JL, Rothe A, Gee KR.
Journal: Cell Calcium (2004): 509

Protein kinase C and myocardial calcium handling during ischemia and reperfusion: lessons learned using Rhod-2 spectrofluorometry
Authors: Stamm C, del Nido PJ.
Journal: Thorac Cardiovasc Surg (2004): 127

Cytosolic calcium in the ischemic rabbit heart: assessment by pH- and temperature-adjusted rhod-2 spectrofluorometry
Authors: Stamm C, Friehs I, Choi YH, Zurakowski D, McGowan FX, del Nido PJ.
Journal: Cardiovasc Res (2003): 695

Calcium measurements in perfused mouse heart: quantitating fluorescence and absorbance of Rhod-2 by application of photon migration theory
Authors: Du C, MacGowan GA, Farkas DL, Koretsky AP.
Journal: Biophys J (2001): 549

Calibration of the calcium dissociation constant of Rhod(2)in the perfused mouse heart using manganese quenching
Authors: Du C, MacGowan GA, Farkas DL, Koretsky AP.
Journal: Cell Calcium (2001): 217

Changes in mitochondrial Ca2+ detected with Rhod-2 in single frog and mouse skeletal muscle fibres during and after repeated tetanic contractions
Authors: Lannergren J, Westerblad H, Bruton JD.
Journal: J Muscle Res Cell Motil (2001): 265

Rhod-2 based measurements of intracellular calcium in the perfused mouse heart: cellular and subcellular localization and response to positive inotropy
Authors: MacGowan GA, Du C, Glonty V, Suhan JP, Koretsky AP, Farkas DL.
Journal: J Biomed Opt (2001): 23

Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death
Authors: Muriel MP, Lambeng N, Darios F, Michel PP, Hirsch EC, Agid Y, Ruberg M.
Journal: J Comp Neurol (2000): 297

说明书
Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒.pdf

mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯 货号1168-AAT Bioquest荧光染料

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。

mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯

mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯

mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯 货号1168 货号 1168 存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格 1 mg 价格 3732
Ex (nm) 537 Em (nm) 657
分子量 806.94 溶剂 DMSO
产品详细介绍

简要概述

光谱流式细胞仪的进步已经超越了常规流式细胞仪的应用范围和功能。现在，借助光谱流式细胞仪分析，研究人员和科学家们可以研究越来越多的目标分子。然而，荧光标记和读数的可用性严重限制了光谱流式细胞术的潜力。AAT Bioquest的mFluor™染料专为针对多色流式细胞仪的应用而开发，尤其是用于光谱荧光流式细胞仪。mFluor™Green 630染料可用532 nm的绿色激发光充分激发。它具有巨大的斯托克斯位移，发射约630 nm。mFluor™Green 630染料是水溶性的，用mFluor™Green 630染料制备的蛋白质结合物在532 nm处激发良好，产生红色荧光。mFluor™Green 630染料和结合物是用于流式细胞仪检测的出色绿色激光试剂。与RPE相比，mFluor™Green 630染料具有更高的光稳定性，使其易于用于荧光成像应用，而由于RPE共轭物的快速光漂白，很难将RPE共轭物用于荧光成像应用。它也是用于光谱流式细胞仪的独特荧光染料，因为很少有具有这种光谱特征的现有染料。

点击查看光谱

产品说明书

样品分析方案 

储备溶液配制

1.蛋白质储备液（溶液A）

将100 µL反应缓冲液（例如1 M碳酸钠溶液或pH值为9.0的1 M磷酸盐缓冲液）与900 µL目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白浓度> 2 mg / mL）混合，得到1 mL蛋白质标记储备液。
注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，请使用1 M碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整为8.0-9.0。
注意：蛋白质应溶于pH 7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果将蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须使用pH 7.2-7.4的1X PBS进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。
注意：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，结合效率会大大降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2.染料原液（溶液B）

在mFluor™Green 630 SE小瓶中加入无水DMSO，制成10-20 mM的储备溶液。通过轻柔移液或涡旋混合均匀。
注意：开始缀合之前，请准备染料储备溶液（溶液B）。立即使用。染料储备溶液的长时间储存​​可能会降低染料活性。避免冻融循环。
注意：收到后，mFluor™Green 630 SE应储存在<-15°C的环境中，并远离光线和湿气。
注意：重新配制的mFluor™染料SE的DMSO储备溶液可以在<-15°C下保存长达4周。
注意：所需的蛋白质偶联物应在载体蛋白质（例如0.1％牛血清白蛋白）存在的情况下以> 0.5 mg / mL的浓度保存。当在2 mM叠氮化钠存在下存储时，结合物溶液可以在4°C下存储两个月而无明显变化。为了更长的存储时间，可以将蛋白结合物冻干或分成单份使用，并保存在≤-60°C下，并避光。

 

操作步骤

该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与mFluor™Green 630 SE的缀合物而开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。

确定最佳的染料/蛋白质比率（可选）

每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比率，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会不利地影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您使用一系列不同量的标记染料溶液，通过实验确定最佳的染料/蛋白质比率。通常，大多数染料-蛋白质结合物推荐使用4-6种染料/蛋白质。

  1. 以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10：1摩尔比为起点：将5 µL染料储备溶液（溶液B，假定染料储备溶液为10 mM）添加到蛋白质瓶中。溶液（95 µL溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg / mL，蛋白质的分子量为〜200KD，则蛋白质的浓度约为0.05 mM。
    注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应小于10％。
  2. 进行缀合反应。
  3. 重复步骤2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1；15：1和20：1。
  4. 使用预制的旋转柱纯化所需的结合物。
  5. 计算上述4种结合物的染料/蛋白质比率（DOS）。
  6. 对以上4种结合物进行功能测试，以确定最佳的染料/蛋白质比率，以扩大标记反应的范围。 
运行缀合反应
  1. 在有效摇动下，将适量的染料储备溶液（溶液B）添加到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中。
    注意：溶液B /溶液的最佳摩尔比由上述步骤确定。如果跳过该步骤（本节：确定最佳的染料/蛋白质比），我们建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10：1。
  2. 在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。 
纯化

以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例。

  1. 准备Sephadex G-25色谱柱。
  2. 将反应混合物（进行共轭反应后的混合物）加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
  3. 样品刚好在顶部树脂表面下方流动时，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。
  4. 向所需样品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4），以完成柱纯化。
    注意：为了立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。
    注意：为了长期保存，染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。 

 

参考文献

A Comprehensive Workflow for Applying Single-Cell Clustering and Pseudotime Analysis to Flow Cytometry Data.
Authors: Melsen, Janine E and van Ostaijen-Ten Dam, Monique M and Lankester, Arjan C and Schilham, Marco W and van den Akker, Erik B
Journal: Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) (2020)

Acquisition of High-Quality Spectral Flow Cytometry Data.
Authors: Fox, Amy and Dutt, Taru S and Karger, Burton and Obregón-Henao, Andrés and Anderson, G Brooke and Henao-Tamayo, Marcela
Journal: Current protocols in cytometry (2020): e74

HTLV infected individuals have increased B-cell activation and proinflammatory regulatory T-cells.
Authors: Kjerulff, Bertram and Petersen, Mikkel Steen and Rodrigues, Candida Medina and da Silva Té, David and Christiansen, Mette and Erikstrup, Christian and Hønge, Bo Langhoff
Journal: Immunobiology (2020): 151878

High-Dimensional Data Analysis Algorithms Yield Comparable Results for Mass Cytometry and Spectral Flow Cytometry Data.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Mayer, Johannes U and Old, Samuel and Hermans, Ian F and Irish, Jonathan and Price, Kylie M
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Mehta, Palak and Harmos, Phoebe and Schmidt, Alfonso J and Chappell, Sally and Price, Kylie M and Hermans, Ian F and Ronchese, Franca and le Gros, Graham and Mayer, Johannes U
Journal: eLife (2020)

Multispectral Flow Cytometry: Unaddressed Issues and Recommendations for Improvement.
Authors: Parks, David R
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

Panel Design and Optimization for High-Dimensional Immunophenotyping Assays Using Spectral Flow Cytometry.
Authors: Ferrer-Font, Laura and Pellefigues, Christophe and Mayer, Johannes U and Small, Sam J and Jaimes, Maria C and Price, Kylie M
Journal: Current protocols in cytometry (2020): e70

Phenotypic Analysis of the Mouse Hematopoietic Hierarchy Using Spectral Cytometry: From Stem Cell Subsets to Early Progenitor Compartments.
Authors: Solomon, Michael and DeLay, Monica and Reynaud, Damien
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2020)

Spectral flow cytometry-Quo vadimus?
Authors: Robinson, J Paul
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2019): 823-824

Time-Delayed Integration-Spectral Flow Cytometer (TDI-SFC) for Low-Abundance-Cell Immunophenotyping.
Authors: Hu, Wenting and Soper, Steven A and Jackson, J Matt
Journal: Analytical chemistry (2019): 4656-4664

说明书
mFluor Green 630琥珀酰亚胺酯.pdf