YF^®488-Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒

产品货号: Y6002S/Y6002M/Y6002L

产品规格: 10T/50T/100T

目录价（元）:281/1061/1591

推荐仪器：流式细胞仪（主推）、荧光显微镜

大包装询价

产品概述：

说明书：

 Y6002S/Y6002M/Y6002L    
MSDS：
MSDS Y6002 YF®488-Annexin V&PI
客户使用反馈：

常见问题解答：

◆为何染色结果显示细胞凋亡率过高？

1. 凋亡时间处理过长，使细胞全部死亡。建议重新摸索细胞凋亡条件，使细胞处于不同的凋亡状态。
2. 对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化时间过长或机械刮擦细胞会暂时破坏质膜，使Annexin V能够与细胞膜胞内面上的磷脂酰丝氨酸结合，导致假阳性染色。建议在胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞后，让细胞在最佳细胞培养条件和培养基中培养约30分钟，以恢复其膜完整性。

◆实验结果使用什么仪器观察？
实验结果可以通过流式细胞仪和荧光显微镜进行观察，但更推荐使用流式细胞仪。因为正常的细胞和凋亡的细胞膜上都有磷脂酰丝氨酸（PS），只是凋亡细胞膜外更多，可以结合更多的Annexin V，流式细胞仪更灵敏，可以区分出微小差异，将正常细胞与凋亡细胞分成不同的两群，但如果用荧光显微镜，可能观察不到这一差别，尤其是贴壁细胞。若要在成像测定中检测细胞凋亡，推荐使用SuperView™ 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。

◆流式细胞仪检测细胞凋亡，结果图中的各个象限代表什么状态的细胞？
左上角：Annexin V-/PI+，机械损伤细胞；右上角: AnnexinV+/PI+，晚期凋亡细胞或坏死；右下角：AnnexinV+/PI-，早期凋亡细胞；左下角：AnnexinV-/PI-，正常细胞。

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 如果需要进行细胞周期检测，推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）

◆各象限代表的细胞状态问题？
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，实验结果越不可信，建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞或坏死。
Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。
Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

◆假阳性问题？
1. 消化液中含有EDTA或消化时间过长引起的假阳性。Annexin V和PS的结合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合剂，使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长，吹打细胞要轻柔，因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性。细胞消化下来后，建议在培养箱中在孵育30min，使细胞膜恢复完整性，避免假阳性，或者将细胞报讯在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
2. 如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。建议：可以含有EDTA的缓冲液200g离心去除血小板， 最后细胞多洗几遍，减小EDTA螯合钙离子产生的影响。
3. 神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。
4. 诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。

◆荧光染料选择的问题？
1. 实验样本是否带荧光，因为感染病毒或质粒转染的细胞往往带GFP荧光，GFP与YF488/FITC通道重叠，不能选择YF488/FITC标记的Annexin V，此时如果只有488 nm一根激光管可以用PE标记Annexin V，用7-AAD代替PI，若有633 nm激光管，可以改用YF647 Annexin V代替YF488。
2. 如果流式细胞仪带有488 nm和633 nm两个或以上激光管，首先考虑用APC或YF647标记 Annexin V，因为它和PI通道几乎不用考虑光重叠问题，可以减少调节补偿的烦恼，如果只有488 nm激光管则可选择YF488/FITC标记的Annexin V。
3. 处理因素是否带有荧光，本实验室就碰到过一个促凋亡药物Doxorubicin本身发红色荧光，对PI通道的检测造成严重干扰，而且浓度越大干扰越明显。这时建议选用A6079或Y6102 。

◆ 圈门问题？
1.要特别注意在FSC/SSC圈门时，所选细胞范围会对结果造成较大影响，所以在分析数据时，要把所有细胞都圈进FSC/SSC的门内，这样实验结果才会更可信。如图，使细胞群大概位于对角线上，并且细胞群较集中，群内细胞比例要在80%以上，如果细胞全部圈入，细胞比例才50%或者更低，说明细胞被压在了坐标轴上，这时要重新调节FSC和SSC。
2.贴壁细胞做Annexin V凋亡检测，通常分群不太规则，这时我们可以根据不加药细胞来画不规则的十字门。如上面图形的设门方式：


◆免疫染色与凋亡染色顺序问题?
Annexin V凋亡染色可以和抗体一起对细胞进行染色吗？
可以，但建议Annexin V和其它抗体分开染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同时标记淋巴细胞，可以先在PBS中标记CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含钙离子）中标记Annexin V。

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 若果需要进行细胞周期检测，推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）

◆固定、冷冻、切片或解离的组织，还可以做流式细胞分析吗？
不建议做流式细胞分析。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，这些状态下的样本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影响，因此无法依赖膜的完整性区分健康细胞和凋亡细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。 液氮保存的◆组织块，可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。

◆Annexin V可以用在植物和细菌中吗？
Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡，具体实验步骤可参考相关文献。

使用本产品的文献：

1.Iron Accumulation Leads to Bone Loss by Inducing Mesenchymal Stem Cell Apoptosis Through the Activation of Caspase3
Ye YuanFei XuYan CaoLi XuChen YuFan YangPeng ZhangLiang WangGuangsi ShenJianrong WangYoujia Xu
Biological Trace Element Research(2018) 434–441
应用方向：流式细胞仪检测：骨髓间充质干细胞的凋亡

2.铁蓄积诱导间充质干细胞凋亡并抑制成骨活性的研究
袁晔, 张鹏王亮, 徐非, 俞晨, 杨帆, 张辉, 易剑桥, 徐又佳
中华实验外科杂志 (2017) 1839-1842 
应用方向：流式细胞仪检测：骨髓间充质干细胞(BMSCs)的凋亡

3.Near-infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform
Yongchun Pan, Jingjing Yang, Xiaowei Luan, Xinli Liu, XUEqing Li, Jian Yang, Ting Huang, Lu Sun, Yuzhen Wang.
Science Advances(2019)
应用方向：流式细胞仪检测：A549细胞的凋亡

4.外泌体介导乳腺癌 MCF-7 细胞对多柔比星耐药性的机制
张如月； 李朵璐； 杨哲； 郭金秀； 周玉冰
药学学报(2019)
应用方向：荧光显微镜凋亡检测：MCF-7、MCF-7/Exo、MCF-7/Dox细胞的凋亡

5.MS-275联合顺铂对食管鳞状细胞癌9706细胞氧化损伤和凋亡的影响
刘腾飞,王亚苹,李亚,张振坤,李喆,周馨魁,张璐玉,王文杰,刘红涛,张彦婷,关方霞,马珊珊
郑州大学生命科学学院
应用方向：流式细胞仪检测：食管鳞状细胞癌(鳞癌) EC9706细胞的凋亡

6.MS-275 combined with cisplatin exerts synergistic antitumor effects in human esophageal squamous cell carcinoma cells
Tengfei Liu，Fangxia Guan，Yaping Wang，Zhenkun Zhang，Ya Li，Yuanbo Cui，Zhe Li，Hongtao Liu，Yanting Zhang，Yuming Wang，Shanshan Ma
Toxicology and Applied Pharmacology Volume 395, 15 May 2020, 114971

7.Deformable liposomal codelivery of vorinostat and simvastatin promotes antitumor responses through remodeling tumor microenvironment
Bin Tu,Yang He,Binfan Chen,Yonghui Wang,Yanrong Gao,Mingjie Shi,Tuanbing Liu,Akmal M. Asrorov，Yongzhuo Huang
Biomaterials Science

8.Effective Genome Editing Using CRISPR-Cas9 Nanoflowers
Chen Zhang , He Ren , Gengqi Liu , Jiexin Li , Xiaojie Wang , Yumiao Zhang 
Advanced Healthcare Materials

YF^®488 TUNEL 细胞凋亡试剂盒（绿色荧光）

产品货号: T6013S/T6013L

产品规格: 20T/50T

目录价（元）:1105/2211

推荐仪器：荧光显微镜（主推）、流式细胞仪

大包装询价

产品概述：

产品货号：

产品规格：

储存条件：-20℃保存，组分A需避光，避免反复冻融。有效期见外包装

产品介绍

细胞发生凋亡时, 会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3′-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与YF® -dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal – deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3′-OH形成,很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。

本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。本试剂盒检测细胞凋亡，耗时短，只需一步染色反应，洗涤后即可检测。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。

3. 实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。

4. 组分A使用时请佩戴口罩、手套，如接触皮肤，请立即用大量水冲洗。

5. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书：

 T6013S/T6013L    
MSDS：
MSDS T6013 6039 6014 6063 YF®488 555 594 640 TUNEL Apoptosis Kit
常见问题解答：

◆为什么出现了一些非特异标记？

1. 有些细胞或组织，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照。
2. 内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。
3. 固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。
6. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。

◆为什么没有染上荧光？
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率.
2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整。
3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。

◆如何对细胞核进行复染？
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。

◆为什么荧光背景高？
1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

◆标记率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。
2. 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。
3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。

◆在蛋白酶K中消化组织样品多久？
大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。 

◆实验的组织切片应该多厚？
老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。

使用本产品的文献：

1.Caffeine Targets SIRT3 to Enhance SOD2 Activity in Mitochondria
Huanhuan Xu, Chunxia Gan, Ziqi Gao, Yewei Huang, Simin Wu, Dongying Zhang, Xuanjun Wang，Jun Sheng
Frontiers in Cell and Developmental Biology

2.Exposure to Automobile Exhaust-Derived PM2.5 Induces Spermatogenesis Dysfunction by Damaging UPRmtof Prepubertal Rats
Cao Wang, Xiang Liu, Zhen Shu, Jia Yin, Mingchen Xiao, Yaya Ai, Peng Zhao, Zhen Luo, Bin Liu

Ecotoxicology and invironmental safety

3.Protective effect and mechanism of Qingfei Paidu decoction on myocardial damage mediated by influenza viruses

Lijuan Du, Jing Zhao, Nanxi Xie4, Huangze Xie, Jiating Xu, Xiaoming Bao, Yingsong Zhou, Hui Liu, Xiao Wu, Xin Hu, Tianyi He, Shujun Xu1, Yuejuan Zheng

Frontiers in Pharmacology

参考文献:
1.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage
应用方向：细胞凋亡染色&流式分析

2.Notch gain of function in mouse periocular mesenchyme downregulates FoxL2 and impairs eyelid levator muscle formation, leading to congenital blepharophimosis
应用方向：切片染色

YF^®594 TUNEL 细胞凋亡试剂盒（红色荧光）

产品货号: T6014S/T6014L

产品规格: 20T/50T

目录价（元）:1105/2211

推荐仪器：荧光显微镜（主推）、流式细胞仪

大包装询价

产品概述：

产品货号：

产品规格：

储存条件：-20℃保存，组分A需避光，避免反复冻融。有效期见外包装

产品介绍

细胞发生凋亡时, 会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3′-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与YF® -dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal – deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3′-OH形成,很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。

本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。本试剂盒检测细胞凋亡，耗时短，只需一步染色反应，洗涤后即可检测。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。

3. 实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。

4. 组分A使用时请佩戴口罩、手套，如接触皮肤，请立即用大量水冲洗。

5. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书：

 T6014S/T6014L    
MSDS：
MSDS T6013 6039 6014 6063 YF®488 555 594 640 TUNEL Apoptosis Kit
常见问题解答：

◆为什么出现了一些非特异标记？

1. 有些细胞或组织，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照。
2. 内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。
3. 固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。
6. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。

◆为什么没有染上荧光？
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率.
2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整。
3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。

◆如何对细胞核进行复染？
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。

◆为什么荧光背景高？
1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

◆标记率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。
2. 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。
3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。

◆在蛋白酶K中消化组织样品多久？
大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。
 
◆实验的组织切片应该多厚？
老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。

使用本产品的文献：

1.OGG1-initiated base excision repair exacerbates oxidative stress-induced parthanatos
Ruoxi Wang, Chunshuang Li, Ping Qiao, Yaoyao XUE, Xu Zheng, Hongyu Chen, Xianlu Zeng,Wenguang Liu, Istvan Boldogh, XUEqing Ba
Cell Death&Disease(2018) DOI： 10.1038/s41419-018-0680-0
应用方向：流式分析

2.VEGF-C/VEGFR-3 axis protects against pressure-overload induced cardiac dysfunction through regulation of lymphangiogenesis
Qiu-Yue Lin, Yun-Long Zhang, Jie Bai, Jin-Qiu Liu, Hui-Hua Li
Clin Transl Med

3.Naringin interferes doxorubicin-induced myocardial injury by promoting the expression of ECHS1
Zirui Zhao，Shilei Yang，Yawen Deng，Liang Wang，Yifen Zhang，Zhenyu Feng，Han Li，Zhongchao Chi，Yunpeng Xie and Deshi Dong
Frontiers in Pharmacology 

4.Semen promotes oocyte development in Sebastes schlegelii elucidating ovarian development dynamics in live-bearing fish

Fengyan Zhang,Weihao Song,Ruiyan Yang, …, Jie Qi, Quanqi Zhang,Yan He     https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.109193

应用方向：使用TUNEL测定法分析了不同发育阶段正常发育的交配（MG）和停滞发育的非交配（NMG）卵巢中的卵巢卵泡凋亡

参考文献
1.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage
应用方向：细胞凋亡染色&流式分析

2.Notch gain of function in mouse periocular mesenchyme downregulates FoxL2 and impairs eyelid levator muscle formation, leading to congenital blepharophimosis

应用方向：切片染色

YF^®647A-Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒

产品货号: Y6026S/Y6026M/Y6026L

产品规格: 10T/50T/100T

目录价（元）:317/1194/1769

推荐仪器：流式细胞仪（主推）、荧光显微镜

大包装询价

产品概述：
储存条件
4℃ 避光冷藏，请勿冻存。有效期见外包装。 

储存条件
4℃避光冷藏，请勿冻存。有效期见外包装。

光谱特性
YF^®647A-Annexin V：Ex/Em = 650/665 nm
PI：Ex/Em = 535/617 nm (with DNA)

产品介绍

说明书：

 Y6026S/Y6026M/Y6026L    
MSDS：
MSDS Y6026 YF®647A-Annexin V and PI Apoptosis Kit
常见问题解答：

◆为何染色结果显示细胞凋亡率过高？

1. 凋亡时间处理过长，使细胞全部死亡。建议重新摸索细胞凋亡条件，使细胞处于不同的凋亡状态。
2. 对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化时间过长或机械刮擦细胞会暂时破坏质膜，使Annexin V能够与细胞膜胞内面上的磷脂酰丝氨酸结合，导致假阳性染色。建议在胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞后，让细胞在最佳细胞培养条件和培养基中培养约30分钟，以恢复其膜完整性。

◆实验结果使用什么仪器观察？
实验结果可以通过流式细胞仪和荧光显微镜进行观察，但更推荐使用流式细胞仪。因为正常的细胞和凋亡的细胞膜上都有磷脂酰丝氨酸（PS），只是凋亡细胞膜外更多，可以结合更多的Annexin V，流式细胞仪更灵敏，可以区分出微小差异，将正常细胞与凋亡细胞分成不同的两群，但如果用荧光显微镜，可能观察不到这一差别，尤其是贴壁细胞。若要在成像测定中检测细胞凋亡，推荐使用SuperView™ 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。

◆流式细胞仪检测细胞凋亡，结果图中的各个象限代表什么状态的细胞？
左上角：Annexin V-/PI+，机械损伤细胞；右上角: AnnexinV+/PI+，晚期凋亡细胞或坏死；右下角：AnnexinV+/PI-，早期凋亡细胞；左下角：AnnexinV-/PI-，正常细胞。

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 如果需要进行细胞周期检测，推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）

◆各象限代表的细胞状态问题？
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，实验结果越不可信，建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞或坏死。
Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。
Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

◆假阳性问题？

1. 消化液中含有EDTA或消化时间过长引起的假阳性。Annexin V和PS的结合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合剂，使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长，吹打细胞要轻柔，因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性。细胞消化下来后，建议在培养箱中在孵育30min，使细胞膜恢复完整性，避免假阳性，或者将细胞报讯在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
2. 如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。建议：可以含有EDTA的缓冲液200g离心去除血小板， 最后细胞多洗几遍，减小EDTA螯合钙离子产生的影响。
3. 神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。
4. 诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。

◆荧光染料选择的问题？
1. 实验样本是否带荧光，因为感染病毒或质粒转染的细胞往往带GFP荧光，GFP与YF488/FITC通道重叠，不能选择YF488/FITC标记的Annexin V，此时如果只有488 nm一根激光管可以用PE标记Annexin V，用7-AAD代替PI，若有633 nm激光管，可以改用YF647 Annexin V代替YF488。
2. 如果流式细胞仪带有488 nm和633 nm两个或以上激光管，首先考虑用APC或YF647标记 Annexin V，因为它和PI通道几乎不用考虑光重叠问题，可以减少调节补偿的烦恼，如果只有488 nm激光管则可选择YF488/FITC标记的Annexin V。
3. 处理因素是否带有荧光，本实验室就碰到过一个促凋亡药物Doxorubicin本身发红色荧光，对PI通道的检测造成严重干扰，而且浓度越大干扰越明显。这时建议选用A6079或Y6102 。

◆圈门问题？
1.要特别注意在FSC/SSC圈门时，所选细胞范围会对结果造成较大影响，所以在分析数据时，要把所有细胞都圈进FSC/SSC的门内，这样实验结果才会更可信。如图，使细胞群大概位于对角线上，并且细胞群较集中，群内细胞比例要在80%以上，如果细胞全部圈入，细胞比例才50%或者更低，说明细胞被压在了坐标轴上，这时要重新调节FSC和SSC。
2.贴壁细胞做Annexin V凋亡检测，通常分群不太规则，这时我们可以根据不加药细胞来画不规则的十字门。如上面图形的设门方式：


◆免疫染色与凋亡染色顺序问题?
Annexin V凋亡染色可以和抗体一起对细胞进行染色吗？
可以，但建议Annexin V和其它抗体分开染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同时标记淋巴细胞，可以先在PBS中标记CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含钙离子）中标记Annexin V。

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 若果需要进行细胞周期检测，推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）

◆固定、冷冻、切片或解离的组织，还可以做流式细胞分析吗？
不建议做流式细胞分析。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，这些状态下的样本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影响，因此无法依赖膜的完整性区分健康细胞和凋亡细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。 液氮保存的◆组织块，可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。

◆Annexin V可以用在植物和细菌中吗？
Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡，具体实验步骤可参考相关文献。

YF^®555 TUNEL 细胞凋亡试剂盒（橙红色荧光）

产品货号: T6039S/T6039L

产品规格: 20T/50T

目录价（元）:1105/2211

推荐仪器：荧光显微镜（主推）、流式细胞仪

大包装询价

产品概述：

说明书：

 T6039S/T6039L    
MSDS：
MSDS T6013 6039 6014 6063YF®488 555 594 640 TUNEL Apoptosis Kit
常见问题解答：

◆为什么出现了一些非特异标记？

1. 有些细胞或组织，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照。
2. 内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。
3. 固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。
6. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。

◆为什么没有染上荧光？
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率.
2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整。
3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。

◆如何对细胞核进行复染？
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。

◆为什么荧光背景高？
1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

◆标记率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。
2. 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。
3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。

◆在蛋白酶K中消化组织样品多久？
大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。 

◆实验的组织切片应该多厚？
老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。

YF^®488-Annexin V/RedNucleus Ⅱ 细胞凋亡试剂盒

产品货号: Y6102S/Y6102M/Y6102L

产品规格: 10T/50T/100T

目录价（元）:317/1194/1769

推荐仪器：流式细胞仪（主推）、荧光显微镜

大包装询价

产品概述：

产品内容：

储存条件

4℃避光冷藏，请勿冻存。有效期见外包装。

光谱特性

YF^®488-Annexin V：Ex/Em=490/515 nm

RedNucleus II：Ex/Em=635/695 nm

产品介绍

Annexin V（膜联蛋白-V）是一种分子量为 35-36 KD的 Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，可与磷脂酰丝氨酸（PS）选择性结合。磷脂酰丝氨酸（PS）主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷脂酰丝氨酸外翻到细胞表面，暴露在细胞外环境中。此时，使用绿色荧光探针 YF^®488的 Annexin V, 即 YF^®488-Annexin V，与外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）结合，就可用流式细胞仪直接检测到磷脂酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。正常细胞不会被 YF^®488-Annexin V所染色，发生凋亡或坏死的细胞会被 YF^®488-Annexin V 所染色。YF^®488-Annexin V可以与部分非渗透性的细胞核染料（7-AAD/PI）等联合使用，区分处于不同凋亡时期的细胞。

本试剂盒中提供的 RedNucleus II 是一种远红光染料，属于蒽醌类化合物，不能透过活细胞和早期凋亡细胞完整的细胞膜，是非渗透性的，但是可以快速染色死亡和透化细胞中的细胞核/dsDNA。RedNucleus II 是一种理想的碘化丙啶（PI）和 7-AAD 的替代物。YF^®488 与 RedNucleus II 之间光谱无交叉。与 YF^®488-Annexin V 联用，对于无自发荧光、自带 RFP 或阿霉素诱导凋亡的细胞，都无需补偿调节。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 为降低细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作，但孵育时间至少延长至30 min。

3. 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后 1 h之内进行分析。

4. 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，RedNucleus II 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 YF^®488-Annexin V的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用 EDTA，EDTA 会影响 Annexin V 与 PS 的结合。

5. 贴壁细胞用胰蛋白酶消化后，建议在最佳培养条件和培养基中恢复约30 min后染色，避免假阳性。

6. 为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的 Tip 头套上小的 Tip 头吸液。

7. 染料的最佳使用浓度由具体实验要求确定。

8. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

9. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书：

 Y6102S/Y6102M/Y6102L    
MSDS：
MSDS Y6102 YF®488-Annexin V and RedNucleus Ⅱ Apoptosis Kit
常见问题解答：

◆为何染色结果显示细胞凋亡率过高？

1. 凋亡时间处理过长，使细胞全部死亡。建议重新摸索细胞凋亡条件，使细胞处于不同的凋亡状态。
2. 对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化时间过长或机械刮擦细胞会暂时破坏质膜，使Annexin V能够与细胞膜胞内面上的磷脂酰丝氨酸结合，导致假阳性染色。建议在胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞后，让细胞在最佳细胞培养条件和培养基中培养约30分钟，以恢复其膜完整性。

◆实验结果使用什么仪器观察？
实验结果可以通过流式细胞仪和荧光显微镜进行观察，但更推荐使用流式细胞仪。因为正常的细胞和凋亡的细胞膜上都有磷脂酰丝氨酸（PS），只是凋亡细胞膜外更多，可以结合更多的Annexin V，流式细胞仪更灵敏，可以区分出微小差异，将正常细胞与凋亡细胞分成不同的两群，但如果用荧光显微镜，可能观察不到这一差别，尤其是贴壁细胞。若要在成像测定中检测细胞凋亡，推荐使用SuperView™ 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。

◆流式细胞仪检测细胞凋亡，结果图中的各个象限代表什么状态的细胞？
左上角：Annexin V-/PI+，机械损伤细胞；右上角: AnnexinV+/PI+，晚期凋亡细胞或坏死；右下角：AnnexinV+/PI-，早期凋亡细胞；左下角：AnnexinV-/PI-，正常细胞。

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 如果需要进行细胞周期检测，推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）

◆各象限代表的细胞状态问题？
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，实验结果越不可信，建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞或坏死。
Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。
Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

◆假阳性问题？

1. 消化液中含有EDTA或消化时间过长引起的假阳性。Annexin V和PS的结合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合剂，使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长，吹打细胞要轻柔，因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性。细胞消化下来后，建议在培养箱中在孵育30min，使细胞膜恢复完整性，避免假阳性，或者将细胞报讯在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
2. 如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。建议：可以含有EDTA的缓冲液200g离心去除血小板， 最后细胞多洗几遍，减小EDTA螯合钙离子产生的影响。
3. 神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。
4. 诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。

◆荧光染料选择的问题？
1. 实验样本是否带荧光，因为感染病毒或质粒转染的细胞往往带GFP荧光，GFP与YF488/FITC通道重叠，不能选择YF488/FITC标记的Annexin V，此时如果只有488 nm一根激光管可以用PE标记Annexin V，用7-AAD代替PI，若有633 nm激光管，可以改用YF647 Annexin V代替YF488。
2. 如果流式细胞仪带有488 nm和633 nm两个或以上激光管，首先考虑用APC或YF647标记 Annexin V，因为它和PI通道几乎不用考虑光重叠问题，可以减少调节补偿的烦恼，如果只有488 nm激光管则可选择YF488/FITC标记的Annexin V。
3. 处理因素是否带有荧光，本实验室就碰到过一个促凋亡药物Doxorubicin本身发红色荧光，对PI通道的检测造成严重干扰，而且浓度越大干扰越明显。这时建议选用A6079或Y6102 。

◆圈门问题？
1.要特别注意在FSC/SSC圈门时，所选细胞范围会对结果造成较大影响，所以在分析数据时，要把所有细胞都圈进FSC/SSC的门内，这样实验结果才会更可信。如图，使细胞群大概位于对角线上，并且细胞群较集中，群内细胞比例要在80%以上，如果细胞全部圈入，细胞比例才50%或者更低，说明细胞被压在了坐标轴上，这时要重新调节FSC和SSC。
2.贴壁细胞做Annexin V凋亡检测，通常分群不太规则，这时我们可以根据不加药细胞来画不规则的十字门。如上面图形的设门方式：


◆免疫染色与凋亡染色顺序问题?
Annexin V凋亡染色可以和抗体一起对细胞进行染色吗？
可以，但建议Annexin V和其它抗体分开染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同时标记淋巴细胞，可以先在PBS中标记CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含钙离子）中标记Annexin V。

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 若果需要进行细胞周期检测，推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）

◆固定、冷冻、切片或解离的组织，还可以做流式细胞分析吗？
不建议做流式细胞分析。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，这些状态下的样本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影响，因此无法依赖膜的完整性区分健康细胞和凋亡细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。 液氮保存的◆组织块，可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。

◆Annexin V可以用在植物和细菌中吗？
Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡，具体实验步骤可参考相关文献。