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TaKaRa LA PCR™ in vitro Cloning Kit
品牌	Code No.	产品名称	包装量	价格（元）	说明书	数量
Takara	RR015	TaKaRa LA PCR™ in vitro Cloning Kit	10 Rxns	￥1,109

■ 制品内容 (10 次量，50 μl PCR)

Sau3A I Cassette(200 ng/μl) 25 μl EcoR I Cassette(20 ng/μl) 25 μl Hind III Cassette(20 ng/μl) 25 μl Pst I Cassette(20 ng/μl) 25 μl Sal I Cassette(20 ng/μl) 25 μl Xba I cassette(20 ng/μl) 25 μl Cassette Primer C1(10 pmol/μl) 20 μl Cassette Primer C2(10 pmol/μl) 20 μl Ligation Solution I* 150 μl Ligation Solution II* 75 μl TaKaRa LA Taq(5 U/μl) 10 μl 10×LA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 100 μl dNTP Mixture (各2.5 mM) 160 μl Control DNA Fragment (100 ng/μl) 25 μl Control Specific Primer CS-1 (10 pmol/μl) 10 μl Control Specific Primer CS-2 (10 pmol/μl) 10 μl     *：Ligation Solution I和II与DNA Ligation Kit Ver.2.1 (Code No.: 6022) 中的组份相同。

■ 制品说明

本试剂盒利用PCR法，使用TaKaRa LA Taq、Cassette以及Cassette Primer，可特异性地扩增cDNA或基因组上的未知区域。通过应用LA PCR技术，提高了保真性能，减少了克隆时变异点的导入。使用本试剂盒，不必经过繁杂的文库构建及筛选等，就能简单地得到基因组等上的长链目的DNA。

■ 保存

-20℃。

■ 原理

本试剂盒原理的具体步聚如下： 1. 用适当的限制酶将待克隆的Target DNA完全分解。 2. 与具有对应的限制酶酶切位点的Cassette进行连接反应。 3. 用Cassette Primer (Primer C1) 和根据已知区域的DNA序列设计的Primer (Primer S1)，进行第1次PCR (1st PCR) 反应。 4. 使用内侧Primer (Primer C2和Primer S2) 进行第2次PCR (2nd PCR) 反应，特异性地扩增目的DNA片段。

图1. 特异性PCR扩增原理图

具体原理见图1。因为在设计上，Cassette的5’末端没有磷酸基，所以Target DNA的3’末端和Cassette的5’末端的连接部位形成缺口。在第一次PCR反应的第一个循环时，从Primer C1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了Primer C1和Primer C1同一引物之间的扩增，从而控制了非特异性PCR扩增。只有从Primer S1开始延伸合成的DNA链，才能成为Primer C1的模板，进行DNA的特异性扩增反应。再用内侧Primer (Primer C2，Primer S2) 进一步进行第二次PCR反应，可以高效特异性地扩增目的DNA。 当蛋白质的氨基酸序列已知时，可以根据已知信息设计Mixed primer代替Primer S1, S2，扩增编码蛋白质的cDNA。

■ 注意事项

1. 37℃室温溶解完全后，用枪头搅拌或上下摇晃microtube使试剂混合均匀。避免剧烈振荡。有时当混合10× LA PCR Buffer 和TaKaRa LA Taq时，小心混匀，避免产生气泡或使酶失活。使用前试剂放置在冰上。 2. 反应前用移液器轻微吸打混匀反应液。不要剧烈振荡。 3. 退火及延伸条件：45-68℃范围内以2℃间隔实验确定最适退火温度。在3 step PCR中，延伸速度为72℃ 1 min./kb。退火-延伸在68℃进行 (2 step PCR)*，同样建议1 min./kb。当温度低于68℃时，需更长时间。 *：由于TaKaRa LA Taq在60-68℃范围内显示出很强活性，可进行Shuttle PCR (Two step PCR)。