上海金畔生物科技有限公司代理Takara Clontech酶试剂盒全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
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| ■ 制品内容 (10 次量) |
| PrimeScript RTase (200 U/μl) |
10 μl |
| RNase Inhibitor (40 U/μl) |
10 μl |
| Oligo(dT)18 Primer (1 μg/μl) |
20 μl |
| Random Primer (9mer) (0.3 μg/μl) |
20 μl |
| 5 × 1st Strand Synthesis Buffer |
40 μl |
| dNTP Mixture (10 mM each) |
40 μl |
| E. coli RNase H/E. coli DNA Ligase Mixture |
20 μl |
| E. coli DNA Polymerase I (20 U/μl) |
20 μl |
| 5 × 2nd Strand Synthesis Buffer |
300 μl |
| T4 DNA Polymerase (1 U/μl) |
40 μl |
| RNase free dH2O |
600 μl × 2 |
| Control RNA (1 μg/μl)* |
5 μl |
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*【Control RNA】
本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。Control RNA (约1.4 kb) 是带有30个A碱基的具有poly (A)+尾的RNA。以这种RNA为模板合成的双链cDNA插入到适当的质粒载体中，如果确实为全长的cDNA，那这种质粒便可获得四环素抗性。 |
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| ■ 制品说明 |
以原核细胞或者真核细胞的mRNA为模板合成cDNA后再进行cDNA的克隆，是分子生物学研究中的一种重要手段。利用这一技术可以容易地进行基因的构造解析和目的蛋白质的表达研究等。
一般来说，cDNA的合成以及cDNA文库的利用方法是：在合成与目的mRNA互补的双链cDNA后，将双链cDNA与细菌或病毒来源的载体进行重组，再将重组体导入细菌或真核细胞内进行复制、扩增cDNA，然后再对cDNA进行解析，或者再进一步进行体外转录或体外翻译等。
本试剂盒主要以来自植物和动物的poly (A)+RNA合成双链DNA 。
本试剂盒主要是以Gubler-Hoffman法为基础构建的，其原理见图1、图2，简要说明如下：
1. 在PrimeScript RTase的作用下，利用Oligo(dT)18 Primer或者Random Primer合成cDNA的第一条链 。
2. 使用E. coli RNase H使DNA-RNA杂合体中的RNA链形成单链切口 (Nick) 。在E. coli DNA Polymerase I 与E. coli DNA Ligase的作用下，RNA链被DNA链置换，合成cDNA的第二条链。
3. 使用T4 DNA Polymerase使双链cDNA片段末端平滑。 |
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| ■ cDNA合成原理图 |
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| 图1 使用Oligo(dT)18 Primer时的cDNA合成 |
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| 图2 使用Random Primer时的cDNA合成 |
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| ■ 保存 |
| -20℃。 |
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| ■ Troubleshooting |
如果实验不能正常进行，请按照说明书内容确认实验操作，检验以下几点：
1. Control RNA的使用
本试剂盒中的Control RNA (pSP Tet3 Poly(A)+ mRNA) 可以用于对照实验，并确认1st Strand cDNA或2nd Strand cDNA的合成反应是否顺利进行。
2. mRNA的纯度检测
为了能够获得更高的cDNA合成效率，尽可能使用完整的mRNA是非常重要的。在进行cDNA合成反应前，可以通过测定260 nm和280 nm的吸光度 (A260/A280在1.8～2.1是理想值) ，或使用琼脂糖凝胶电泳法对RNA的纯度进行检测。
3. RNase的污染
实验时要注意一定不能在mRNA的样品中混入RNase。实验用的器具、试剂等应尽可能进行高温灭菌处理。操作过程要佩戴手套。 |
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