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E.coli JM109 Electro-Cells酶试剂盒Takara Clontech – 修饰性PEG
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■ 制品内容 |
E.coli JM109 Electro-Cells |
50 μl × 10 |
pUC19 plasmid ( 10 pg/μl) |
10 μl |
SOC Medium* |
1 ml × 10 |
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*SOC Medium: 2% |
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Tryptone |
0.5% |
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Yeast extract |
10 mM |
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NaCl |
2.5 mM |
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KCl |
10 mM |
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MgSO4 |
10 mM |
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MgCl2 |
20 mM |
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Glucose |
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■ 制品说明 |
Electro-Cells是Takara Bio特别制备的适用于电穿孔法的制品。用高电压脉冲电流瞬间击穿细胞的细胞质膜,从而使外源DNA转入宿主细胞内的转化方法称为电穿孔法。通过此种方法制备的感受态细胞转化效率高、产量大,尤其适合在短时间内将少量样品转入大肠杆菌内。 由于E. coli JM109 Electro-Cells含有F' 质粒,可以作为M13噬菌体载体的宿主细胞,也可用于制作DNA文库或进行亚克隆。当转化pUC载体或转染M13噬菌体载体DNA时,重组体可以利用电转化细胞的β-半乳糖苷酶的α-互补性,通过添加X-Gal和IPTG很容易地筛选出来。 X-Gal : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside IPTG : Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside |
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■ 细胞浓度 |
>1×1010 bacteria/ml |
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■ Genotype |
E. coli JM109: recA1 , endA1 , gyrA96 , thi -1 , hsdR17 (rk-mk+), e14-(mcrA- ) supE44 , relA1 , Δ (lac-proAB )/F'[traD36 , proAB+, lacIq, lacZ ΔM15] |
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■ 保存 |
-80℃。 注意: -80℃或更低温度下保存。如果保存温度不能恒定,转化降低将会降低。请使用附带的pUC19 对照质粒来确认保存细胞的转化效率。不能液氮保存。 |
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■ 质量标准 |
转入10 pg 的pUC19,涂于含有Amp+ 的选择培养基进行筛选。 转化效率 : >1 x 109 cfu/μg pUC19 |
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■ 注意事项 |
1. 将Electro-Cells从-80℃取出后请立即置于干冰/乙醇中。使用前保存于干冰/乙醇中。 |
2. 当使用50 μl Electro-Cells时,添加不多于10 ng的高纯度样品DNA。否则会降低转化效率。 |
3. 导入分子量较大的DNA (>7 kb) 时,转化效率降低。 |
4. 当改变实验规模时,适当改变反应条件。 |
5. L-broth 或φb-broth可替代SOC培养基。此时,转化效率可能会降低。 |
·L-broth : |
Ingredient |
per liter water |
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Tryptone |
10 g |
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Yeast extract |
5 g |
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NaCl |
5 g |
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用1 N NaOH调整pH7.5并高压灭菌。 |
·φ b-broth: |
Ingredient |
per liter water |
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Tryptone |
20 g |
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Yeast extract |
5 g |
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MgSO4·7H2O |
5 g |
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用1 N KOH调整pH7.5并高压灭菌。 |
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6. 稀释时,使用“使用方法4”中加入的SOC培养基。 |
7. YT soft agar: |
Ingredient |
per 100 ml water |
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Tryptone |
0.8 g |
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Yeast extract |
0.5 g |
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NaCl |
0.5 g |
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用1 N NaOH调整pH7.6,添加agar至浓度为0.6%,高压灭菌。 |
8. 制备感受态细胞。当DNA插入M13噬菌体载体克隆位点时,重组体可通过在YT-soft agar添加X-Gal 和IPTG进行筛选,因为非重组体存在于蓝斑中。 |
9. YT-plate: |
Ingredient |
per liter water |
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Tryptone |
8 g |
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Yeast extract |
5 g |
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NaCl |
5 g |
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用1 N NaOH调整pH7.6,添加agar至浓度为1.5%,高压灭菌。 |
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10. 当加入X-Gal或IPTG时,按照以下方法操作: |
·加入100 mM IPTG,100 μl-300μl IPTG/100 ml agar medium 和 25 μl IPTG /3 ml soft agar。 |
·加入20 mg/ml X-Gal(溶解于二甲基甲酰胺)到agar medium中,比例为200 μl-300 μl /100 ml。若使用 soft agar,比例为50 μl/3 ml。 |
11. 不建议将解冻的感受态细胞再次冷冻保存。但是,如果再次冻结不可避免,将细胞置于干冰/乙醇中快速冷冻,置于-80℃保存。但是,转化效率可能会降低至少一个数量级。 |
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