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单细胞水平人T细胞受体分析
品牌	Code No.	产品名称	包装量	价格（元）	说明书	数量
Clontech	634431	SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit	96 Rxns	￥48,426
Clontech	634432	SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit	480 Rxns	￥149,865

SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit— 阐明单细胞中T细胞受体Alpha-Beta 链配对

· 工作流程灵活—可以利用FACS（流式细胞术）或手动分选细胞构建 Illumina测序文库 · 易于使用—优化的index允许将96个细胞混合制成12个文库，    并可以进一步混合在一个flow-cell lane中测序 · 灵敏度高—基于RACE方法可以检测低丰度TCR变异体 · 特异性好—完整reads，大部分reads可以比对到目标区域，提供准确链配对信息

尽管批量T细胞测序有助于进一步了解T细胞受体库（TCR）多样性，但是批量测序不能确定T细胞群内特定的alpha-beta 受体链配对信息。由于特定的TCR alpha-beta链配对介导抗原特异性，获得配对信息对于深入了解抗原识别，靶向免疫治疗TCR的有效设计至关重要，也有助于确立T细胞群的祖先关系。单个T细胞测序可以确定特定细胞的配对信息，但是价格可能非常昂贵并涉及复杂的分析，因为大部分方法需要对大量的细胞测序。

使用SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit可以解决这些问题，在SMART cDNA Synthesis中通过采用一系列indexed oligo可以将手动或FACS分选的96个样品制成12个测序pool，并且这12个pool可以进一步混合，这样所有的96个样品可以在一个flow-cell lane 中测序。与用于大量样品测序的SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit 一样，试剂采用了SMART cDNA synthesis和RACE方法，通过进一步的TCR基因特异性PCR完整捕获和扩增TCR-alpha 和TCR-beta可变区构建Illumina测序文库，为TCR测序提供了一种高灵敏度的方法。

如果您需要软件对采用本试剂盒构建文库测序获得的数据进行demultiplex分析，请登录SMARTer Human scTCR Demultiplexer。

图1. 在单细胞水平进行T细胞研究的优势。

Panel A. T细胞受体alpha链 (TCR-α) 和beta链组成示意图。 Panel B. 示意了难以从批量细胞测序数据中获得alpha链 (TCR-α) 和beta链配对信息。针对稀有克隆型可以分析部分细胞中的配对信息（橙色克隆型），但是对于高表达的克隆型(TCRA V2J1, TCRA V2J2, TCRB V3D1J1, TCRB V2D1J2)可能有4种配对组合。

图2. SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit技术流程及pooling策略。

Panel A. 第一链cDNA合成由dT引物（RT引物）起始，MMLV型逆转录酶（RT）会在mRNA 5’端添加几个非模板核苷酸。SMART-Seq Indexed Oligos与这几个非模板核苷酸互补结合作为模板，通过RT在第一链cDNA末端添加额外核苷酸序列（也就是模板转换步骤）。试剂盒中提供8种不同的SMART-Seq Indexed Oligo，每一个SMART-Seq Indexed Oligo中内嵌唯一的六碱基index作为细胞barcode，用于下游pooling细胞的识别。通过RT添加到cDNA末端的额外序列-被称为“SMART sequence”-作为接下来几轮PCR扩增的引物结合位点，确保只有来自于全长cDNA的序列才能被扩增。经过pool（Panel B所示）和纯化后，通过连续两轮基因特异性PCR扩增来自于TCR-α 和/或 TCR-β可变区的cDNA序列。第一轮PCR采用扩增过的双链cDNA为模板，正向引物与SMART sequence互补，同时包含Illumina Read 2序列（TCR Primer 1），反向引物与TCR-α和TCR-β的恒定区（即不变区）互补（TCR a/b Human Primer 1）。第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，采用的正向引物与第一轮PCR添加的Read 2 序列互补。反向引物与恒定区结合，位于PCR1 primers内侧 (TCR a/b Human Primer 2 Reverse HT Index)，扩增TCR-α和TCR-β cDNA的完整可变区及部分恒定区。正向引物和反向引物包含适用于Illumina测序平台的接头序列和index，可以将多达96个样品混合用于在一个flow-cell lane中测序。Panel B. 按列混合样品，这样每个pool中包含8个细胞，每个细胞带有不同index的SMART-Seq Indexed Oligo 。在PCR 2中通过正向和反向HT indexes的不同组合使用，可以将多样品进一步混合在一个flow-cell lane 中测序（更多信息参见User Manual）。

图3. 96孔板中混合细胞群的分析。

Panel A. 基于鉴别每孔的克隆型确定细胞种类。遗漏的7个细胞没能通过对高于阈值的TCR-α 或TCR-β的reads数分析确定克隆型。Panel B. 配对信息分析。分析获得了平板中34个细胞的TCR-αβ配对克隆型。Panel C. 以百分比展示了分析细胞的alpha，beta，或alpha-beta配对信息。遗漏的细胞没有包括在分析数据中。

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视频资料：在单细胞水平对人T细胞受体库分析的解决方案

Takara Bio USA公司Dr. Ankita Das和Dr. Sarah Taylor探讨可以实现分析每个细胞中的TCRα和TCRβ链的可变区全长序列，构建测序文库的SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit。