LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒为 cDNA 合成和 PCR 扩增提供了简化方案。其中的 5X 反应预混液含有 dNTPs，经优化适用于多重靶标检测，且操作便捷。其中的 25X 酶预混液含有 Luna WarmStart 反转录酶和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶。适配体抑制酶活技术可对上述两种酶活进行双重温控，因此可室温建立反应体系，且预混体系可室温稳定保存 24 小时。该试剂盒具备强大的多重靶标扩增能力，适用于诊断、病原体检、病毒基因组测序等多种应用（例如：ARTIC SARS-CoV-2 测序方案，每个反应扩增 ~50 个扩增子）。

LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒 (NEB #E1555) 仅需添加 RNA 模板和基因特异性引物，即可在一次反应中对多个 cDNA 靶标进行合成和扩增。扩增后的 cDNA 产物可通过下游应用进行检测或鉴定，包括：二代测序、DNA 芯片、片段分析、电泳和传统的克隆/测序。

 

图 2：LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒的灵敏度和多重检测性能卓越

使用 LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒 (NEB #E1555) 或 SuperScript IV One-Step RT-PCR System (Thermo Fisher Scientific) 对人脾总 RNA 的 7 个靶标（185–776 bp）进行扩增。取 40% 的 RT-PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶（2%）电泳检测。LunaScript 使用标准反应条件：引物终浓度为 1 μM，退火时间为 1 分钟。SSIV 使用推荐反应条件无法扩增所有条带，因此还测试了其它关键参数：改变引物浓度和退火时间。结果显示：LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒可成功扩增不同起始量 RNA 模板中的所有 7 个靶标，但 SuperScript IV One-Step RT-PCR System 经调整反应条件，甚至增模板量，都无法扩增所有靶标。

 

图 3：LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒可完成 ARTIC SARS-CoV-2 测序方案

 

 使用 LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒和来自 NEB (A) 或 IDT (B) ARTIC V3 引物进行多重扩增，扩增模板为 1000 拷贝 SARS-CoV-2 病毒 gRNA (ATCC VR-1986)，该模板掺入到 100 ng 通用人类参考 RNA（Thermo Fisher Scientific^®，QS0639）中使用。将 cDNA 合成体系一式两份成 12.5 μl 体系，分别使用引物库 1 和 2 进行扩增。反应条件为：55℃ 20 分钟（反转录），98℃ 1 分钟（RT 灭活/初始变性），之后进行 35 个循环的扩增：95℃ 15 秒，63℃ 5 分钟（退火和延伸）。

使用 NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台）和 1.3 μl 的上述扩增产物进行文库构建，使用 MiSeq® 仪器 (2X75 bp) 测序。为每个文库绘制每个扩增子的测序  Reads。使用 seqtk（250,000 read pairs）向下抽样 Reads 数，并使用 Bowtie 2 比对至 SARS-CoV-2 参考基因组（NCBI，NC_045512）。参考线表示 100 reads 的典型质量阈值。

 

图 4：试剂可室温放置长达 24 小时，RNA 的检测效果仍然灵敏和稳健

 

使用 LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒 (NEB #E1555) 对 GAPDH 靶标（570 bp）进行扩增，样品为 0.01 ng-10 ng 的 Jurkat 总 RNA。反应体系在冰上建立并立即运行（对照）或在热循环前室温放置 1、4 或 24 小时。每种条件下都设有无模板对照（NTC）。结果显示：所有上样量均完成了高度灵敏和特异的靶标扩增，预混体系室温放置长达 24 小时后也达到了同样的效果。

 

图 5：LunaScript 与 OneTaq 一步法 RT-PCR 试剂盒的比较