无需纯化，直接从细胞到 RNA 定量

•   试剂盒包含 100 次裂解反应和 500 次探针一步法 RT-qPCR 反应

•   有效裂解多种细胞系的 10 至 10 万个细胞

•  仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除

•   配合使用 LunaWarmStart^® RT 和 Hot Start Taq，提高了热稳定性且可在室温下建立反应体系

•   可单独购买裂解模块：Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032）

 

 Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接探针法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分，且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒包含两个模块：1）Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032S）和 2）Luna 通用探针一步法 RT-qPCR Kit（NEB＃E3006L）。

细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA。

 

Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂，可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10-10 万个细胞进行裂解反应。2 µl 裂解产物 （相当于 0.2–4000 个细胞的 RNA） 即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样，裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料，使整个加样流程可视化。 

Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可兼容大多数实时荧光定量仪器的各个通道，进行目标 RNA 的实时定量分析。在该试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接将 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量（单重或多重）。

下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 log 梯度稀释（100000-10 细胞/50 µl 裂解反应），并取 1 ul 裂解产物进行 20 µl 体系的一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外，经测试一些昆虫细胞系也能用上述裂解液裂解。

 

 

表一：经验证过的细胞系

 

细胞系

 

	特性	菌种	50 ml 裂解体系中的细胞数量
A549	Adherent	H. sapiens, Lung, carcinoma	10 – 100,000
HEK293	Adherent	H. sapiens, Kidney	10 – 100,000
HeLa	Adherent	H. sapiens, Cervix, adenocarcinoma	10 – 100,000
HepG2	Adherent	H. sapiens, Liver, carcinoma	10 – 100,000
NCI-H460	Adherent	H. sapiens, Lung, carcinoma	10 – 100,000
SK-N-SH	Adherent	H. sapiens, Brain, Neuroblastoma	10 – 100,000
U2Os	Adherent	H. sapiens, Bone, osteosarcoma	10 – 10,000
Jurkat	Suspension	H. sapiens, T lymphocyte, leukemia	10 – 100,000
K-562	Suspension	H. sapiens, Lymphoblast, leukemia	10 – 1,000

 图一：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程

 

Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从细胞（50 µl 体系可裂解高达 10 万个细胞）到 RNA 检测和定量的所有组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物（相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA）即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。 

 

图二：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对 5-log 梯度稀释细胞的裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量

 

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3006），加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞）对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。结果展示了两个高频靶标：β-actin（Texas Red）和 GAPDH（FAM），一个低频靶标：RPL32（HEX），的多重结果（A）和单重结果（B），以及相应的扩增效率（E）和线性关系（R²）。（C）所有三个目标的多重和单重的 Cq 叠加证明了这些结果的一致性。

三：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒与提纯 RNA 均可对 5-logs 细胞梯度样品进行精准可信的 RNA 定量

 

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解，也可使用柱提法提纯 RNA。A.使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3006）对目的基因进行定量，加入 1 μl 细胞裂解物（实心圆，左）或纯化的 RNA（空心圆，右）（上样量相当于 20 µl RT-qPCR 反应中有 0.2-2,000 个细胞），每个浓度的样品都做了重复。在 5-logs 细胞梯度中检测高频靶标 β-actin 和两个低频靶标 ARF3 和 Tubulin。每个靶标的扩增效率在图中左下方显示。

图四：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。相同的样品使用 Bio-Rad（SingleShot™ Probes One-Step Kit for Cell Lysis and RT-qPCR, #172-5070）、Qiagen（FastLane Cell Probe Kit, #216413）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit, A25603）并分别按照厂家说明书进行裂解。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块，加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞），对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。5-log 梯度稀释的细胞通过多重实验测试了 β-actin （Tye）、GAPDH （FAM）和 RPL32 （Cy5）的扩增。为了使结果标准化，将每个试剂盒总荧光值的 10％（Tye）、5％（FAM）、15％（Cy5）设置为阈值。图中显示了扩增效率（E）及最高与最低的 Cq 值。

试剂盒组分

随该产品提供的试剂

	储存（°C）	浓度
Luna Cell Ready Lysis Buffer	-20	2 X
Luna Cell Ready RNA Protection Reagent	-20	25 X
Luna Cell Ready Protease	-20	25 X
Luna Cell Ready Stop Solution	-20	10 X
DNase I （RNase-free）	-20	10 X
Luna® WarmStart® RT Enzyme Mix	-20	20 X
Luna® Universal Probe One-Step Reaction Mix	-20	2 X
Nuclease-free Water	-20

 实验需要但不提供的试剂耗材

•  磷酸盐缓冲液（PBS）

•   目标特异性引物

•   细胞

•   Eppendorf 管

•   PCR联管

•   PCR 板

•   qPCR 仪器

•   移液器和枪头（为减少交叉污染，应使用带滤芯的枪头）

 储存温度

-20℃