适用仪器

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荧光酶标仪
激发：	540nm
发射：	590nm
cutoff：	570nm
推荐孔板：	黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1. 准备并添加胆碱标准品和/或测试样品（50 µL）
2. 准备并添加胆碱测定工作溶液（50 µL）
3. 在室温下孵育15-60分钟
4. 检测Ex / Em = 540/590nm时的荧光强度

 

溶液配制

储备溶液配制

1. Amplite Red储备液（250X）：将40 µL DMSO（组分E）添加到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中，应立即使用储备溶液。应将所有剩余的溶液等分，并在-20^oC重新冷冻。注意1：避免重复冻融循环。注意2：在存在硫醇（例如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇）的情况下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应不高于10 µM。Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的测定缓冲液（pH 7.4）。

2.胆碱标准储备液（50 mM）：将400 µL ddH₂O加入胆碱标准液（组分C）的小瓶中，并充分混合。注意：未使用的胆碱储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在-20^oC下储存。

 

标准溶液配制

将20 µL胆碱标准储备液（50mM）加到980 µL分析缓冲液（组分D）中，生成1000 µM标准溶液。注意：  稀释的胆碱标准溶液不稳定，应在4小时内使用。将30 µL的1000 µM标准溶液加到970 µL的测定缓冲液（组分D）中以生成30 µM胆碱标准溶液，然后进行1：3系列稀释，以得到10、3、1、0.3、0.1、0.03和0 µM胆碱标准。

 

工作溶液配制

胆碱测定工作溶液：
将5 mL测定缓冲液（组分D）添加到胆碱探针瓶（组分B）中，并充分混合。在胆碱探针中加入20 µL Amplite Red 储备溶液（250X）。

 

实验步骤

表1.黑色96孔板中胆碱标准品和测试样品的布局。CS =胆碱标准（CS1-CS7）；BL =空白对照；TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
CS1	CS1	…	…
CS2	CS2	…	…
CS3	CS3
CS4	CS4
CS5	CS5
CS6	CS6
CS7	CS7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
CS1 – CS7	50 µL	连续稀释 (0.03 to 30 µM)
BL	50 µL	缓冲液 (组分 D)
TS	50 µL	测试样品

胆碱测定：

1.如表1和表2所述，将胆碱标准品和含胆碱的测试样品添加到黑色96孔板中。

2.在胆碱标准液，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 µL胆碱测定工作溶液（表2），使总胆碱测定体积为100 µL /孔。 注意：对于384孔板，将25 µL样品和25 µL测定反应混合物加到每个孔中。

3.避光保存，室温下孵育反应15至60分钟。

4.使用荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570 nm / 590-600 nm（最佳Ex / Em = 540/590 nm）处检测荧光强度。

 

图示

图1.使用Gemini荧光酶标仪（Molecular Devices）在黑色96孔板上用Amplite 胆碱定量试剂盒获得胆碱剂量响应。 30分钟的孵育时间（n = 3）可以检测到低至100 nM（10皮摩尔/孔）的胆碱。

 

 

参考文献

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